Identificação de genes desregulados Induzida pelo Herpesvirus sarcoma de Kaposi-associado (KSHV)
Summary
Fatores da célula hospedeira desempenham um papel fundamental no estabelecimento e manutenção de sarcoma de Kaposi (KS). Esboçamos métodos para identificar os fatores da célula hospedeira alterado em células infectadas pelo KSHV DMVEC, e em KS tecido tumoral. Genes celulares alterados por vírus vai servir como potencial alvo (s) para novas terapêuticas.
Abstract
Atualmente KS é o mais predominante malignidade HIV / SIDA na África Austral e, consequentemente, do mundo. 1,2 Caracteriza-se como um tumor angioproliferativas de células endoteliais vasculares e produz raras doenças linfoproliferativas de células B na forma de linfomas derrame pleural (PEL) e algumas formas de doença multicêntrica de Castleman. 3-5% Somente 1-5 de células em lesões KS apoiar activamente a replicação lítica de sarcoma de Kaposi associado herpesvirus (KSHV), o agente etiológico associado com KS, e é claro que fatores celulares deve interagem com fatores viral no processo de oncogênese e progressão do tumor 6,7. Identificação de novas anfitrião fator determinantes que contribuem para KS patologia é essencial para o desenvolvimento de marcadores prognósticos para a progressão tumoral e metástases, bem como para o desenvolvimento de novas terapêuticas para o tratamento de KS 8. Os detalhes de vídeo que acompanha os métodos que usamos para identificar célula hospedeira programas de expressão gênica alterada em células endoteliais microvasculares dérmicas (DMVEC) após a infecção KSHV e em KS tecido tumoral. 9 Depois genes desregulados são identificadas por análise de microarray, mudanças na expressão de proteínas são confirmados por immunoblot e imunofluorescência rotulados dual. Mudanças na expressão transcricional de genes desregulados são confirmados in vitro quantitativa por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR). Validação dos resultados in vitro utilizando tecido tumoral de arquivamento KS também é realizada por imunoquímica rotulados dupla e microarrays do tecido. 8,10 Nossa abordagem para identificar genes desregulados no microambiente tecido tumoral KS permitirá o desenvolvimento de testes in vitro e posteriormente em sistemas modelo in vivo para descoberta e avaliação da terapêutica romance potencial para o tratamento do sarcoma de Kaposi.
Protocol
Discussion
As metodologias utilizadas neste relatório pode ser realizada em uma variedade de configurações de laboratório. Eles exigem algum equipamento especial ou acesso às instalações do núcleo. Precauções apropriadas devem ser tomadas ao fazer experimentos envolvendo patógenos virais infecciosas como KSHV que pode exigir a utilização de um nível de Biossegurança 3 (NB-3) instalações. Aquisições de tecido também deve ser aprovado pelo apropriado conselhos de revisão institucional (IRBs).
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a James EK Hildreth, Meharry Medical College, pelos seus conselhos e revisão do manuscrito. Agradecemos também a Diana Marver para a edição do manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Vanderbilt Meharry Center for AIDS Research (NIH conceder AI054999 P30-05), o Center for AIDS Research Disparidades de Saúde, NIH conceder 5U54 RR019192-05, o Centro de Pesquisa Clínica Meharry, NIH Grant P20RR011792, e pelo NIH conceder P01 CA113239. DJA foi parcialmente financiado por doações piloto do Centro de Vanderbilt-Meharry para AIDS Research (CFAR) e do Centro de Pesquisa Clínica Meharry (CRC).
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | ||
| TPA | Sigma | P1585 | ||
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | ||
| Sodium butyrate | Sigma | 19364 (FLUKA) | ||
| EBM-2 media | Lonza | CC-3156 | + bullet kits supplement | |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza | CC2543 | ||
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | ||
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Chamber slides | Nalgene | 154461 | ||
| KSHV LANA Mab | Vector Labs | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA | |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | ||
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoRessearch | 705-095-1 | ||
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoRessearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA | |
| Mounting media | Vector Labs | H 1500 | Vectashield with DAPI | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | ||
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | ||
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz | SC 2020 | ||
| Western substrate | Pierce | 34075 | ||
| Biotin-rabbit-anti goat | DAKO | 305-065-045 | ||
| AP-Strepavidin conj. | DAKO | K 0492 (kit) | ||
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | ||
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | ||
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | ||
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall | 46910 | ||
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | 392052 | ||
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | ||
| TE 2000S Fluorescent microscope | NIKON | TE2000S | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C | ||
| Eclipse E 200 | NIKON | E 200 | ||
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo | 75004377 |
Referenzen
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