במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה לבידוד יחידים או מרובים<em> תסיסנית</em> נוירונים דה מן הזחלים instar third באמצעות לכידת אינפרא אדום (IR) מעמד של Microdissection לכידת לייזר (LCM). RNA המתקבלים נוירונים בודדים יכולים לשמש בקלות עבור יישומים במורד הזרם כולל qRT-PCR או microarray מנתח.
דנדריטים (דה) arborization נוירונים במערכת העצבים ההיקפית תסיסנית (PNS) לספק מערכת מודל מצוינת בה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס בכיתה ספציפית המורפוגנזה 1,2 דנדריט. כדי להקל על ניתוח מולקולרי של מחלקה ספציפית דה נוירון פיתוח, חיוני להשיג תאים אלה באוכלוסייה טהור. למרות מגוון רחב של תאים שונים, ספציפיים רקמות טכניקות בידוד RNA קיימים תאים תסיסנית, כולל טיהור תא חרוז מגנטי מבוסס 3,4, תא פלורסנט מיון פעיל (FACS) 5-8, ו – RNA חלבון מחייב מבוסס אסטרטגיות 9, אף אחד שיטות אלה יכול להיות מנוצל בקלות לבידוד בודדות או מרובות בכיתה ספציפית תסיסנית נוירונים דה עם רמה גבוהה של דיוק מרחבית. Microdissection לייזר לכידת (LCM) התפתחה ככלי רב עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי לבודד את סוגי תאים מסוימים ממקטעים רקמה עם רמה גבוהה של דיוק ברזולוציה מרחבית. RNA בתאים מבודדים המתקבל לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ניתוחים כולל qRT-PCR ו פרופיל microarray ביטוי בתוך סוג תא נתון 10-16. עד כה, LCM לא הוחל נרחב בניתוח של רקמות ותאים תסיסנית 17,18, כולל נוירונים דה בשלב instar third הזחל של התפתחות.
כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה שלנו הבידוד של נוירונים תסיסנית דה באמצעות מעמד אינפרא אדום (IR) של LCM. שיטה זו מאפשרת ללכוד של, נוירונים בודדים דה בכיתה ספציפית או מספר עם סגוליות גבוהה ברזולוציה מרחבית. גיל בהתאמה third הזחלים instar להביע כטב"מ-mCD8: 19-GFP transgene בשליטת גם את הרביעי בכיתה דה נוירון ספציפי פ.פ.ק.-20 GAL4 הנהג או פאן דה נוירון ספציפי 21-7 21-GAL4 הנהג שימשו אלה ניסויים. RNA המתקבלים נוירונים בודדים דה הוא באיכות גבוהה מאוד וניתן להשתמש בו ישירות ליישומים במורד הזרם, כולל qRT-PCR או microarray מנתח. יתר על כן, פרוטוקול זה LCM ניתן להתאים בקלות ללכוד סוגים אחרים תסיסנית תא בשלבים שונים של פיתוח תלויים בסוג תא מסוים, GAL4 מונחה דפוס הביטוי של ה-GFP.
פרוטוקול המוצגת כאן מתארת את שיטת אופטימיזציה שלנו הבידוד של נוירונים תסיסנית הפריפריה באמצעות LCM. אמנם זה פרוטוקול LCM תוכנן עבור בידוד הספציפי של יחיד, מחלקה ספציפית או מספר הנוירונים תסיסנית דה משלב instar third הזחל של פיתוח, שינויים קלים של פרוטוקול יכול ב…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים בני הזוג. Yuh-Nung יאן ווס Grueber למתן מניות לטוס השתמשו במחקר זה, ווירג'יניה Espina, ד"ר עמנואל Petricoin ד"ר לאנס ליוטה לסיוע עם LCM. המחברים להכיר תומס פ קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון על התמיכה של מחקר זה (DNC) ואת אוניברסיטת ג'ורג' מייסון מכללה משרד s (EPRI).
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
Dry ice |
Equipment: