De electroolfactogram (EOG), de opname is een informatieve, gemakkelijk te voeren, en betrouwbare manier te beoordelen olfactorische functie op het niveau van het reukepitheel. Dit protocol beschrijft een recording setup, muis weefsel voorbereiding, het verzamelen van gegevens, en de elementaire data-analyse.
Dieren zijn afhankelijk van reukzin voor vele kritieke gedragingen, zoals het vinden van voedsel bronnen, het vermijden van roofdieren, en het identificeren van soortgenoten om te paren en andere sociale interacties. De electroolfactogram (EOG), de opname is een informatief, makkelijk uit te voeren, en betrouwbare methode voor het testen van olfactorische functie op het niveau van het reukepitheel. Sinds de 1956 beschrijving van het EOG door Ottoson in kikkers 1, heeft de EOG opname is toegepast in veel gewervelde dieren waaronder salamanders, konijnen, ratten, muizen en mensen (beoordeeld door Scott en Scott-Johnson, 2002, ref. 2). De recente ontwikkelingen in genetische modificatie bij muizen hebben weer interesse in het opnemen van de EOG voor de fysiologische karakterisatie van olfactorische functie in knock-out en knock-in muizen. EOG opnames zijn met succes toegepast op de centrale rol van olfactorische signaaltransductie componenten 3-8 aan te tonen, en meer recent de bijdrage van bepaalde regulerende mechanismen 9-12 te karakteriseren OSN reacties.
Geurstof detectie plaatsvindt aan het oppervlak van het reukepitheel op de trilharen van OSNs, waar een signaaltransductie cascade leidt tot het openen van de ionkanalen, het genereren van een stroom die uitmondt in de trilhaartjes en depolariseert het membraan 13. Het EOG is de negatieve potentieel extracellulair opgenomen in het oppervlak van het reukepitheel op geurstof stimulatie, als gevolg van een opsomming van de mogelijke wijzigingen veroorzaakt door individuele reageren OSNs in de opname veld 2. Vergelijking van de amplitude en de kinetiek van de EOG dus waardevolle informatie over hoe genetische modificatie en andere experimentele manipulaties van invloed op de moleculaire signalering ten grondslag liggen aan de OSN reactie op de geur.
Hier beschrijven we een air-fase EOG opname op een voorbereiding van de muis olfactorische neusschelpen. In het kort, na het opofferen van de muis, de olfactorische neusschelpen blootgesteld door halverend het hoofd over de middellijn en het verwijderen van het septum. De turbinate voorbereiding is dan geplaatst in de opname setup, en een registratie-elektrode wordt geplaatst aan het oppervlak van het reukepitheel op een van de mediale neusschelpen. Een referentie-elektrode is elektrisch verbonden met het weefsel door middel van een bufferoplossing. Een continue stroom van bevochtigde lucht wordt geblazen over het oppervlak van het epitheel om het vochtig te houden. De damp van geurende oplossingen wordt opgeblazen in de stroom van bevochtigde lucht aan het epitheel te stimuleren. Reacties worden geregistreerd en gedigitaliseerd voor verdere analyse.
Met de instellingen beschreven in dit protocol, zal de geurstof stimuli aan het oppervlak van het reukepitheel in overeenstemming zijn tussen de weefselpreparaten, waardoor vergelijking tussen wild type en mutante muizen, hoewel de exacte odorant concentratie en dynamiek onbekend zijn. Een aantal factoren, met name de opname locatie en het debiet van de bevochtigde lucht, variaties veroorzaken in de EOG. Zorg moeten worden genomen om op te nemen van soortgelijke posities op dezelfde turbinate om de variatie te minimaliseren. Dit kan gemakkelijk worden bereikt door het consequent opnemen van dezelfde kant van het hoofd en houden van de footprint van de microscoop, de geur levering buis, en micromanipulators op de lucht tafel onveranderd tussen weefselmonsters. Daarnaast moeten weefsel onmiddellijk te worden geplaatst in de bevochtigde lucht stroom na de sectie te veel uitdrogen van het weefsel te voorkomen.
EOG opnames op muizen kan ook worden uitgevoerd met een vloeistof perfusie apparaat op voorbereid muis neusschelpen 7, 14, 15, of door het verlaten van het hoofd intact en het inbrengen van de elektrode in een klein gaatje geboord boven de neusschelpen 16, 17. Elke variatie van EOG opname heeft zijn eigen sterke punten: air-fase-opnamen op weefselpreparaten zoals beschreven in dit protocol vereisen een minimale hoeveelheid van de installatie en zijn het makkelijkst uit te voeren; opnamen met behulp van een vloeistof perfusie apparatuur te bevorderen van het gebruik van farmacologische reagentia, hoewel de hydrofobe karakter van veel geurstoffen bemoeilijkt geur levering, ten slotte, opnamen waarin het hoofd is intact gelaten kan worden gebruikt in 'kunstmatige snuffelen' experimenten, hoewel plaatsing van de elektroden is moeilijker dan wanneer de neusschelpen zijn volledig blootgesteld.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken dr. Yijun Song, en leden van de Hattar Kuruvilla Zhao tri-lab van het departement Biologie, Johns Hopkins University voor advies en hulp. Ondersteund door NIH beurzen DC007395 en DC009946.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Air delivery tube | equipment | Custom fabricated | The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute | |
Air table | equipment | Newport | LW3030B-OPT | |
Amplifier | equipment | Warner | DP-301 | |
Computer and Data Acquisition Software | equipment | Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh | Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/. | |
Butane torch | equipment | A crème brûlèe torch works well | ||
Digitizer | equipment | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
Dissecting Scope | equipment | Scienscope | SSZ | |
Electrode holder | equipment | Harvard Apparatus | 64-1021 | |
Magnetic Holding Devices (12 mm) | equipment | World Precision Instruments | M10 | |
Micromanipulators | equipment | World Precision Instruments | M3301R M3301L |
|
Micropipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P2000 | |
Oscilloscope | equipment | Tektronix | 5110 | |
Picospritzer III | equipment | Parker Instrumentation | ||
Silicone tubing | equipment | Nalge Nunc | ||
Specimen stage | equipment | Custom fabricated | Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay. | |
18 gage needles | material | Becton Dickinson | 305195 | |
2 oz. glass bottles | material | VWR International | 16152-201 | |
Glass capillaries | material | World Precision Instruments | TW150F-6 | |
Silicone stoppers size 16D | material | Chemware | D1069809 | |
Silver wire | material | World Precision Instruments | AGW1010 | |
SylGuard 184 | material | Dow Corning | SYLG184 | From World Precision Instruments |
Agarose | reagent | Invitrogen | 15510-027 | |
Amyl acetate | reagent | Aldrich | W504009 | |
Calcium chloride (CaCl2) | reagent | Sigma | C-1016 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | reagent | Sigma | D5879 | |
HEPES | reagent | Fisher | BP310 | |
Heptaldehyde | reagent | Aldrich | H2120 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O) | reagent | Sigma | M9272 | |
Sodium chloride (NaCl) | reagent | JT Baker | 3624-05 | |
flowmeter | equipment | Gilmont | GF-2260 |