Summary

Multicolor Citometria a Flusso di analisi Cellular risposta immunitaria in macachi Rhesus

Published: April 22, 2010
doi:

Summary

Abbiamo dimostrato l'utilità di citometria a flusso multicolore per informazioni dettagliate caratterizzazione fenotipica e funzionale del totale così come sottoinsiemi memoria di CD4 + e CD8 + T nei macachi rhesus, il modello ideale per l'HIV / AIDS studi vaccino.

Abstract

Il modello di macaco rhesus è attualmente il miglior modello disponibile per l'HIV-AIDS rispetto alla comprensione della patogenesi e per lo sviluppo di vaccini e terapie<sup> 1,2,3</sup>. Qui, descriviamo un metodo per l'analisi dettagliate fenotipica e funzionale delle risposte immunitarie cellulari, in particolare la produzione di citochine intracellulari di CD4 + e CD8 + T, oltre che i sottoinsiemi memoria individuale. Abbiamo ottenuto precise misure quantitative e qualitative per la produzione di interferone gamma (INF-) e interleuchina (IL) -2 in entrambi i CD4 + e CD8 + T cellule del macaco rhesus PBMC stimolati con PMA più ionomicina (PMA + I). I profili delle citochine erano diverse nei diversi sottoinsiemi di celle di memoria. Inoltre, questo protocollo ci ha fornito la sensibilità per dimostrare anche le frazioni minori di specifico antigene CD4 + e CD8 + sottogruppi di cellule T nei campioni di PBMC da macachi rhesus immunizzati con un vaccino cocktail busta peptide HIV sviluppate nel nostro laboratorio. La tecnica di citometria a flusso multicolore è un potente strumento per identificare con precisione le diverse popolazioni di cellule T<sup> 4,5</sup> Con citochine capacità di produzione<sup> 6</sup> In seguito a stimolazione aspecifica o antigene-specifiche<sup> 5,7</sup>.

Protocol

Le procedure per l'analisi dettagliate fenotipica e funzionale del totale così come sottoinsiemi di cellule T di memoria può essere diviso in quattro parti: 1) Preparazione delle cellule e stimolazione antigenica, 2) indicatore colorazione superficiale, 3) colorazione delle citochine intracellulari e 4) La citometria a flusso analisi. 1. Preparazione delle cellule e la stimolazione antigenica Sia appena isolato e crio-conservato le cellule mononucleate del sangue periferico …

Acknowledgements

Dr. Pramod Nehete e la signora Bharti Nehete macaco di sangue e campioni PBMC; Questo lavoro è stato parzialmente supportato con fondi dal NIH concedere AI 46969, e tutti i terreni di coltura cellulare sono stati prodotti dai Media Central Laboratory, che è finanziato dal NIH concedere CA 16672.

Materials

Solution and Buffers

  • Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
  • Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
  • L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
  • Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
  • Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
  • 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
  • Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
  • Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
  • BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)

Activation agents

  • Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
  • Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein

Cytokine secretion inhibitors

  • Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)

Antibodies

  • Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
  • CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
  • CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J. Vis. Exp. (38), e1743, doi:10.3791/1743 (2010).

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