Summary

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Published: March 05, 2010
doi:

Summary

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح اجراءات التنشيط CD40 ، والتوسع في خلايا الفئران B من splenocytes من C57BL / 6 الفئران ، والتي يمكن استخدامها بوصفها خلية مستضد تقديم نموذج (APC) لدراسة تحريض الحصانة.

Abstract

وقد أظهرت البحوث على الخلايا البائية أن التنشيط CD40 يحسن قدرتها على تقديم المستضد. عندما حفز مع وانترلوكين 4 – CD40 يجند (CD40L) ، يمكن توسيع خلايا B الإنسان دون صعوبات من كميات صغيرة من الدم المحيطي في غضون 14 يوما لكميات كبيرة جدا من خلايا CD40 – B نقية عالية (> 10<sup> 9</sup> خلايا لكل مريض) من المتبرعين الأصحاء فضلا عن مرضى السرطان<sup> 1-4</sup>. CD40 – B المهم التعبير عن جزيئات الخلايا اللمفاوية صاروخ موجه ، ويمكن أن تجذب الخلايا التائية<em> في المختبر</em<sup> 5</sup>. وعلاوة على ذلك أنها تأخذ بكفاءة أعلى ، والعملية الحالية لمستضدات الخلايا التائية<sup> 6،7</sup>. عرضت CD40 – B الخلايا ليست فقط ساذجة الوزراء ، وإنما أيضا توسيع الخلايا التائية الذاكرة<sup> 8،9</sup>. ولذلك قد درست CD40 تنشيط خلايا B (CD40 – B الخلايا) كمصدر بديل للالمناعية تنشيطية مستضد تقديم الخلايا (APC) لخلية مقرها immunotherapy1 ، 5،10. من أجل مزيد من الدراسة ما إذا كانت الخلايا CD40 – B تحفز الاستجابات فعالية الخلايا التائية في الجسم الحي ، ودراسة الآلية الكامنة أنشأنا نظاما ثقافة الخلية لتوليد خلايا الفئران B – CD40 تفعيلها. كانوا يستخدمون splenocytes أو تنقيتها من خلايا الفئران C57BL B / 6 ، لتفعيل CD40 ، حددت الظروف المثلى على النحو التالي : يتم تنقيتها ابتداء من splenocytes من C57BL / 6 الفئران (النمط الفرداني H – 2B) الخلايا الليمفاوية بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة وشارك في تربيتها مع هيلا خلايا الفئران معربا عن المؤتلف CD40 يجند (tmuCD40L هيلا)<sup> 11</sup>. هي خلايا recultured كل 3-4 أيام والمكونات الرئيسية مثل CD40L ، انترلوكين 4 – المركابتويثانول ويتم تجديد السيكلوسبورين A. في هذا البروتوكول ونحن لشرح كيفية الحصول على تفعيلها بشكل كامل الفئران CD40 – B الخلايا (mCD40B) مع APC – مماثل النمط الظاهري لخلايا CD40 – B الإنسان (الشكل 1A ، ب). CD40 – يؤدي إلى تحفيز نمو السريع والتوسع في نقية للغاية (> 90 ٪) CD19 خلايا B + في غضون 14 يوما من زراعة الخلايا (الشكل 1C ، د). لتجنب التلوث مع المنظمات غير transfected الخلايا ، والتعبير ليجند CD40 الفئران على transfectants يجب أن يكون للرقابة بشكل منتظم (الشكل 2). ويمكن استخدام الفئران CD40 تنشيط خلايا B لدراسة الخلية B – التنشيط والتمايز ، وكذلك للتحقيق إمكاناتها لتؤدي وظيفة APC في المختبر والمجراة. وعلاوة على ذلك ، لأنها تمثل أداة واعدة لإقامة التطعيم علاجية أو وقائية ضد الأورام وسوف تساعد على الإجابة عن الأسئلة المتعلقة بالسلامة واستمناع هذا النهج<sup> 12</sup>.

Protocol

ينقسم بروتوكول لجيل من الفئران خلايا B – CD40 تنشيط (mCD40B) من splenocytes إلى جزأين : الجزء ألف يوضح إعداد يجند CD40 الفئران (CD40L) معربا عن خلايا هيلا (tmuCD40L هيلا) ، والتي سوف تستخدم لوحة ، كما منضم الخلايا المغذية. الجزء باء يصف الفعلية الفئران CD40 – B الثقافة. <p class="jove_title" style=";text-align:ri…

Discussion

إدخال تعديلات على هذا البروتوكول أمر ممكن ، وخصوصا فيما يتعلق أصل التحفيز CD40 ونوع السلالة الماوس المستخدمة ، مما أسفر أيضا في توليد خلايا الفئران كفاءة B – CD40 تفعيلها. الأحمدي وآخرون. وقد أظهرت نتائج مماثلة بالنسبة لالليفية الماوس transfected مع الفئران CD40 – يجند. ويمكن في ه…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور كليمنس تتكرم Wendtner لتوفير tmuCD40 – يجند الحله خط الخلية.

Materials

A. Preparation of Media:

Feeder cell wild type medium Feeder cell selection medium  
Reagent Concentration Reagent Concentration
RPMI 1640   RPMI 1640  
L-Glutamine 300 μg/mL L-Glutamine 300 μg/mL
FBS 10 % FBS 10 %
HEPES 10 mM HEPES 10 mM
Gentamycin 15 μg/mL Gentamycin 15 μg/mL
   Hygromycin B 0.2 mg/mL
mCD40-B washing medium mCD40-B culture medium
Reagent Concentration Reagent Concentration
D-MEM
D-MEM
L-Glutamine 580 μg/mL L-Glutamine 580 μg/mL
Glucose 4.5 mg/mL Glucose 4.5 mg/mL
HEPES 10 mM HEPES 10 mM
Gentamycin 15 μg/mL Gentamycin 15 μg/mL


MEM 0.1mM (1x)


FBS 10%

B. Miscellaneous Reagents:

Reagent Company Order No
RPMI 1640 Invitrogen Gibco® REF 21875
D-MEM Invitrogen Gibco® REF 41965
Dulbecco´s PBS (10x) PAA Cat No H15-011
Gencin® Delta Select Art No 7395800
FBS LONZA Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Cat No S11-001
MEM NEAA Invitrogen Gibco® REF 11140
Hygromycin B PAA Cat No P02-015
Recombinant Murine Interleukin-4 Immunotools Cat No 12340045
Cyclosporin A Novartis Cat No NDC 0078-0109-01
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen Gibco® REF 15400-054

C. Miscellaneous Supplies:

Reagent Company Order No
Sterile pipette tips Sarstedt  
6-well plate NUNC Cat No 140675
50mL conical tube BD Falcon™ Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Cat No 83.1813.002

Referenzen

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
  2. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
  3. Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
  4. Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
  5. von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
  7. Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
  8. Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
  9. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
  10. Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
  11. Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
  12. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Liebig, T. M., Fiedler, A., Klein-Gonzalez, N., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. Murine Model of CD40-activation of B cells. J. Vis. Exp. (37), e1734, doi:10.3791/1734 (2010).

View Video