Methoden zur Untersuchung des Zebrafisch Maxillary Barbel

Zebrafisch Tierhaltung Zebrafische sind untergebracht und nach der Norm Methoden 1 aufgezogen. Vorbei am späten Larvenstadien Frist kann der Entwicklungsstand eines Zebrafisch durch seine Standard-Länge (SL), oder die gerade Linie in Millimetern von der vordersten Punkt der Oberlippe an der Basis der Schwanzflosse (posteriormost hypural Platte) gemessen werden 2. Bei ca. 1 Monat nach der Befruchtung (10-12 mm SL), erscheinen die Nasen-und Kieferhöhle Barben als transparent epithelialen Knospen in der Nähe des Riechgruben und auf den hinteren Ecken des Oberkiefers bzw.. Da der Zebrafisch reift, erstrecken sich die Barben in schmale, whisker Fortsätzen. Da die oberen Barbe ist größer (2-3 mm) und leichter zu manipulieren, gilt unser Protokoll nur für diese besondere Anhängsel; ähnliche Techniken konnte jedoch zu den kleineren nasalen Barben angepasst werden. Barbel Clipping Betäuben erwachsenen Zebrafisch auf die gewünschte Stufe (z. B.., 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 Monate nach der Befruchtung) durch Eintauchen in 0,015% MS-222 (Ethyl-3-Aminobenzoesäure Methansulfonat) gepuffert auf pH 7,0 im System Wasser. Beachten Sie, bis schwimmen Bewegungen zu stoppen und gill Belüftung wird langsam und regelmäßig. Je nach Größe der Fische, nimmt Vollnarkose ca. 2-5 Minuten. Mit einem Aquarium Fischnetz, Transfer 1-3 Fische auf einmal zu einem gefalteten Stück nassen Papiertuch in einer Petrischale. Mit einem stumpfen Spatel, orientieren die Fische, so dass sie parallel zueinander und linken lateralen Seite bis sind. Falten Sie ein Teil der nassen Papiertuch über den hinteren Teil der Fische, die den gesamten Körper bis zum Operculum (Kiemendeckel), um die Haut und Kiemen feucht während des Verfahrens. Sehen Sie sich die Petrischale unter dem Stereomikroskop, mit geringem Winkel einfallende Licht auf den Kopf zu beleuchten. Konzentrieren Sie sich auf der Basis der linken Oberkiefer-Barbe, die von der hinteren ventralen Ecke des Oberkiefers (Abb. 1) ragt. Abbildung 1. Dicht erfassen die Welle der Barbe leicht distal an den Rand des Oberkiefers. Elevate die Barbe Welle und legen Sie die Backen einer spitzen Feder Schere genau proximal der Pinzette. Die Schere kann die Zange für die Stabilität berührt werden. Schieben Sie die Backen der Schere entlang der Welle der Barbe, bis die Schneide nähert sich der Rand des Oberkiefers. Schließen Sie die Schere durch die Barbe Welle geschnitten. Die amputiert Barbe, noch griff in die Zange, kann zur Fixierung oder weitere Beobachtung entfernt werden. Sofort überweisen Sie den Fisch auf einem kleinen Tank mit sauberem Wasser System (~ 500 ml) enthält einen Tropfen Methylenblau zu oberflächliche Pilzinfektion zu kontrollieren. Lassen Sie den Fisch über Nacht erholen. Am nächsten Morgen kehren die Fische, die Aufzucht-System. Barbel Regeneration nach 2 Wochen maximal. Agar Einbettung von Matched Pairs Barbel Sammeln Sie Fische durch geeignete Euthanasie Technik und fix in einem 50 ml-Röhrchen mit 4% Paraformaldehyd-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Rühren bei 4 ° C über Nacht. Die Fixierlösung sollte mindestens das Zehnfache des Volumens des Gewebes werden. Nach der Fixierung von Paraformaldehyd Abfälle in einer zugelassenen Behälter und spülen Sie das Gewebe gründlich in mehrere Änderungen der PBS. Bereiten Sie sich in einem 250 ml-Glasflasche 150 ml 2% Agarose (T m ~ 37 ° C) in destilliertem Wasser. Hitze mit einer Mikrowelle oder Heizplatte, Rühren in regelmäßigen Abständen, bis sie vollständig aufgelöst. Äquilibrieren das geschmolzene Lösung in einem 50-60 ° C Wasserbad. Bauen Sie ein Standard-Gel-Elektrophorese rig, indem Sie einen kleinen gedichtete Gelform (10 x 10 cm; ~ 100 mL Gelvolumen) fest gegen die Seiten der Pufferkammer. Fügen Sie 2-4 kleinen Zähnen Probe Kämme (4 x 1,5 mm). Auf einer ebenen Fläche, gießen Sie die geschmolzene Agarose in die Form gerade bedeckt die Basis der Waben bilden sehr seichten Brunnen. Sofort setzen die übrig gebliebenen Agarose zurück in den warmen Wasserbad, das wird später verwendet werden, um das Gewebe (Schritte 9-12) einbinden. Legen Sie ein langes Glas Pasteur Pipette in den Kolben der Pipette auf die gleiche Temperatur wie die Agarose zu halten. Lassen Sie das Gel zu härten für 20-30 Minuten. Entfernen Sie die Kämme, entfernen Sie dann das Gel enthaltende Form der gehärteten Gel aus der Pufferkammer. Fest Band die offenen Seiten des Gels Form mit Labor-Band so das Gel nicht rutscht aus. Diese Band sollte einige Millimeter über der Oberfläche der Agarose zu verlängern, so dass zusätzliche Agarose später hinzugefügt werden können (Schritt 13). Positionieren Sie die Gelform auf der Bühne ein Stereomikroskop. Magnify einen leeren Brunnen und bringen die Kanten in den Fokus. Auf die Oberfläche der Agarose neben dem gut, einen Tropfen von Wasser oder Puffer, der den festen Barben Proben (zB, regenerieren und Kontrolle). Using gebogen Insektennadeln, ziehen Sie den feuchten Proben in den Brunnen und schieben Sie sie nach unten. Orient die Barbe Wellen parallel zueinander ausgerichtet und an gegenüberliegenden langen Kanten des Brunnens. Die Oberflächenspannung wird dazu beitragen, halten das Gewebe in Position. Wenn Sie bereit sind zu verankern, mit einem feinen Pipettenspitze oder die Ecke eines Labors Gewebe, um überschüssige Flüssigkeit aus dem Brunnen zu entfernen. Arbeiten Sie schnell, um nicht zu lassen, das Gewebe austrocknen. Mit der erwärmten Glas Pasteur Pipette vorsichtig Pipette frisch geschmolzene Agarose in und um die Proben zu den Barben Gewebe an Stelle abzudichten. Nicht überfüllen. Bevor die Agarose erhärtet, machen Last-Minute-Korrekturen mit dem Insekt Pins. Legen Sie eine nummerierte Papier Probe Etikett neben dem Brunnen und sichern Sie sie mit einem kleinen Tropfen Agarose. Wiederholen Sie die Schritte 6 bis 10 für jede Vertiefung der Proben. Wenn für die Bild-Kalibrierung gewünscht, legen Sie ein Blatt Papier mit einem gedruckten Mikrometerbereich (zB http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) in den Boden eines leeren Brunnen. Streichen Sie das Papier auf den Boden des Brunnens und decken Sie es mit warmen Agarose. Nachdem alle Proben eingebettet sind, wird die Oberfläche des Gels werden unregelmäßig, mit gehärteter Tropfen Agarose. Legen Sie das Gel auf eine ebene Fläche und sanft in zusätzliche geschmolzener Agarose pour bis die Oberfläche gleichmäßig ist. Verwenden Sie die kleinste Menge an Agarose notwendig, um eine glatte Oberfläche zu erhalten, zu viel Agarose wird Durchlicht-Fotografie im Dunkeln. Lassen Sie diese oberste Schicht zu härten. Das Gel kann nun auf der Bühne ein Stereomikroskop auf grobe Morphologie für jede Barbe Paar Rekord fotografiert werden. Bild Kalibrierung durch Fotografieren der embedded Mikrometerbereich erreicht. Das ganze Gel gespeichert eingewickelt in feuchte Papiertücher und versiegelt in einem Plastikbeutel bei 4 ° C für mehrere Wochen. Zur weiteren Analyse können Agar Blöcke mit zwei gepaarten Barben aus dem Gel geschnitten werden mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge und verarbeitet Paraffin Histologie oder Kryoschneiden nach Standardmethoden 3,4. Alternativ können einzelne Barben aus der Agarose seziert werden mit feinen Nadeln, in Wasser gespült, und verarbeitet für andere Downstream-Anwendungen (zB ganze-mount Immunhistochemie oder die konfokale Mikroskopie).