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A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise
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生物学
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JoVE 杂志 生物学
The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

DOI:
10.3791/1746-v

•

19:16 min

•

March 17, 2010

•

1GE Healthcare Bio-Sciences AB

Chapters

  • 00:00Title
  • 01:38Introduction
  • 02:30Experimental Design
  • 03:58Immobilization of the Ligand Papain for CFCA Analysis
  • 07:34Determining Cystatin B Concentration Using the CFCA Assay
  • 11:07Measuring the Kinetics of Cystatin B binding to Papain
  • 17:13CFCA assay and Kinetics of Cystatin B binding to Papain Representative Results
  • 18:47Conclusion

Summary

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Nós aplicamos rótulo sem análise da interação da proteína usando X100 Biacore para estrutura-função de análise da ligação de mutantes B várias cistatina à papaína através da caracterização cinética. Calibração livre de análise de concentração (ACCP) mede a concentração de proteína com actividade de ligação retida sem a necessidade de uma curva padrão. Nós mostramos que a confirmação de concentrações usando ACCP aumenta a confiabilidade da análise cinética e que constantes cinéticas pode ser determinada de forma confiável, mesmo que a atividade de uma proteína recombinante é reduzida.

Tags

Protein ConcentrationKineticsAffinity DeterminationStructure-function AnalysisCysteine Protease InhibitorCystatin BPapainReal-time Label-free AnalysisBiacore X100Point MutationsInteractionCalibration-free Concentration Analysis (CFCA)A280Single-cycle Kinetics (SCK)Association Rate Constant (ka)Affinity (KD)Reliable ResultsInteraction Mechanism

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