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Analytical Chemistry

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High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

00:00概述
01:22Principles of HPLC
05:05Preparation of the Mobile Phase
06:08Preparation of Component and Standard Solutions
07:25HPLC Setup
09:25Diet Soda Samples
10:16Results
11:27Applications
12:44Summary

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Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)

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概述

Fonte: Dr. Paul Bower – Purdue University

La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è un importante metodo analitico comunemente usato per separare e quantificare componenti di campioni liquidi. In questa tecnica, una soluzione (prima fase) viene pompata attraverso una colonna che contiene un imballaggio di piccole particelle porose con una seconda fase legata alla superficie. Le diverse solubilità dei componenti del campione nelle due fasi fanno sì che i componenti si muoano attraverso la colonna con velocità medie diverse, creando così una separazione di questi componenti. La soluzione pompata è chiamata fase mobile, mentre la fase nella colonna è chiamata fase stazionaria.

Esistono diverse modalità di cromatografia liquida, a seconda del tipo di fase stazionaria e/o mobile impiegata. Questo esperimento utilizza la cromatografia a fase inversa, in cui la fase stazionaria è non polare e la fase mobile è polare. La fase stazionaria da impiegare sono i gruppi di idrocarburi C18 legati a particelle di silice da 3 μm, mentre la fase mobile è un tampone acquoso con un modificatore organico polare (acetonitrile) aggiunto per variare la sua forza di eluizione. In questa forma, la silice può essere utilizzata per campioni solubili in acqua, fornendo una vasta gamma di applicazioni. In questo esperimento, le miscele di tre componenti che si trovano frequentemente nelle bevande analcoliche dietetiche (vale a dire caffeina, benzoato e aspartame) sono separate. Vengono utilizzate sette soluzioni preparate contenenti quantità note delle tre specie e vengono quindi registrati i loro cromatogrammi.

Principles

Durante un esperimento HPLC, una pompa ad alta pressione prende la fase mobile da un serbatoio attraverso un iniettore. Quindi viaggia attraverso una colonna imballata inversa C18 per la separazione dei componenti. Infine, la fase mobile si sposta in una cella di rilevamento, dove l’assorbanza viene misurata a 220 nm e termina in una bottiglia di scarto. La quantità di tempo necessaria affinché un componente viaggi dalla porta dell’iniettore al rilevatore è chiamata tempo di ritenzione.

In questo esperimento viene utilizzato un cromatografo liquido, in cui la separazione viene eseguita su una colonna a fase inversa. Le dimensioni della colonna sono 3 mm (i.d.) x 100 mm e l’impacchettamento di silice (dimensione delle particelle di 3 μm) è funzionalizzato con C18 octadecylsilane (ODS). Una valvola di iniezione rotativa Rheodyne a 6 porte viene utilizzata per conservare inizialmente il campione in un piccolo anello e introduce il campione nella fase mobile dopo la rotazione della valvola.

Il rilevamento avvieni mediante spettroscopia di assorbimento ad una lunghezza d’onda di 220 nm. Questo esperimento può essere eseguito a 254 nm, se un rivelatore non è variabile. I dati del rilevatore hanno un’uscita di tensione analogica, che viene misurata utilizzando un multimetro digitale (DMM) e letta da un computer caricato con un programma di acquisizione dati. Il cromatogramma risultante ha un picco per ogni componente del campione. Per questo esperimento, tutti e tre i componenti elute entro 5 minuti.

Questo esperimento utilizza una singola fase mobile e una pompa, che è chiamata fase mobile isocratica. Per i campioni difficili da separare, è possibile utilizzare una fase mobile gradiente. Questo è quando la fase mobile iniziale è principalmente acquosa e, nel tempo, una seconda fase mobile organica viene gradualmente aggiunta alla fase mobile complessiva. Questo metodo aumenta la polarità di questa fase nel tempo, che abbassa i tempi di ritenzione dei componenti e funziona in modo simile a un gradiente di temperatura su un gascromatografo. Ci sono alcuni casi in cui la colonna viene riscaldata (di solito a 40 ° C), il che elimina eventuali errori di tempo di ritenzione associati a un cambiamento della temperatura ambiente.

Nell’HPLC a fase inversa, l’imballaggio in fase stazionaria della colonna è solitamente un imballaggio C4, C8 o C18. Le colonne C4 sono principalmente per proteine con grandi pesi molecolari, mentre le colonne C18 sono per peptidi e campioni di base con pesi molecolari inferiori.

Il rilevamento mediante spettroscopia di assorbimento è in modo schiacciante il metodo di rilevamento preferito, poiché gli spettri di assorbimento dei componenti sono tutti prontamente disponibili. Alcuni sistemi utilizzano misure elettrochimiche, come la conducibilità o l’amperometria, come metodo di rilevamento.

Per questo esperimento, la fase mobile è principalmente il 20% di acetonitrile e l’80% di acqua deionizzata purificata (DI). Una piccola quantità di acido acetico viene aggiunta per abbassare il pH della fase mobile, che mantiene il silanolo nella fase di imballaggio stazionario in uno stato non dissociato. Ciò riduce il picco di adsorbimento dalla coda, dando picchi più stretti. Quindi, il pH viene regolato con idrossido di sodio al 40% per aumentare il pH e contribuire a ridurre i tempi di ritenzione dei componenti.

Ogni gruppo utilizza un insieme dei 7 flaconcini contenenti diverse concentrazioni delle soluzioni standard (Tabella 1). I primi 3 vengono utilizzati per identificare ogni picco e gli ultimi 4 per la creazione di un grafico di calibrazione per ciascun componente. Gli standard 1-3 sono utilizzati anche per la tabella di calibrazione.

Numero	Caffeina (mL)	Benzoato (mL)	Aspartame (mL)
1	4	0	0
2	0	4	0
3	0	0	4
4	1	1	1
5	2	2	2
6	3	3	3
7	5	5	5

Tabella 1. Volumi di standard di magazzino utilizzati per preparare i 7 standard di lavoro forniti (il volume totale di ogni standard è di 50 ml).

Procedure

1. Fare la fase mobile Preparare la fase mobile aggiungendo 400 ml di acetonitrile a circa 1,5 L di acqua DI purificata. Aggiungere con attenzione 2,4 ml di acido acetico glaciale a questa soluzione. Diluire la soluzione ad un volume totale di 2,0 L in un matraccio volumetrico con acqua DI purificata. La soluzione risultante dovrebbe avere un pH compreso tra 2,8 e 3,2. Regolare il pH a 4,2 aggiungendo il 40% di idrossido di sodio, in base alle gocce con l’uso di un pHmetro digitale calibrato. Aggiungere molto lentamente una volta che il pH raggiunge 4.0. Questo dovrebbe richiedere circa 50 gocce per realizzare. Filtrare la fase mobile attraverso un filtro a membrana nylon 66 da 0,47 μm sotto vuoto per degassare la soluzione e rimuovere i solidi che potrebbero tappare la colonna cromatografica. È importante degassare la fase mobile per evitare di avere una bolla, che potrebbe causare un vuoto nella fase stazionaria all’ingresso della colonna o farsi strada nella cella del rivelatore, causando instabilità con l’assorbanza UV. 2. Creazione delle soluzioni dei componenti I tre componenti che devono essere prodotti sono caffeina (0,8 mg / mL), benzoato di potassio (1,4 mg / mL) e aspartame (L-aspartyl-L-fenilalanina metile estere) (6,0 mg / mL). Queste concentrazioni, una volta diluite nello stesso modo, mettono gli standard ai livelli trovati nei campioni di soda. Aggiungere 0,40 g di caffeina in un matraccio volumetrico da 500 ml, quindi diluire fino al segno di 500 ml con acqua DI. Aggiungere 0,70 g di benzoato in un matraccio volumetrico da 500 ml, quindi diluire fino al segno di 500 ml con acqua DI. Aggiungere 0,60 g di aspartame a un matraccio volumetrico da 100 ml, quindi diluire fino al segno di 100 ml con acqua DI. Mettere questa soluzione in frigorifero per evitare la decomposizione durante la conservazione. 3. Realizzare le 7 soluzioni standard I tre componenti hanno tutti coefficienti di distribuzione diversi, che influenzano il modo in cui ciascuno interagisce con entrambe le fasi. Maggiore è il coefficiente di distribuzione, maggiore è il tempo che il componente trascorre nella fase stazionaria, con conseguenti tempi di ritenzione più lunghi nel raggiungere il rivelatore. Seguendo il grafico della tabella 1, convogliare la quantità corretta di ciascun componente in un matraccio tarare da 50 ml. Diluire ciascuna delle soluzioni stock fino al segno di 50 ml sui palloni volumetrici con fase mobile. Versare ogni soluzione standard in piccoli flaconcini etichettati in un rack di campioni. Conservare le scaffalature dei campioni in frigorifero, insieme alle soluzioni rimanenti nei palloni volumetrici da 50 ml. 4. Verifica delle impostazioni iniziali del sistema HPLC Verificare che la linea dei rifiuti si trova in un contenitore dei rifiuti e che non venga riciclata nella fase mobile. Verificare che la portata della fase mobile sia impostata su 0,5 ml/min. Questo è abbastanza alto da consentire a tutti i picchi di eluire entro 5 minuti e abbastanza lento da consentire una buona risoluzione. Verificare che la pressione minima e massima e la portata siano impostate sui valori corretti sul pannello frontale del sistema di erogazione del solvente (la pompa). Impostazione della pressione minima: 250 psi (questo per spegnere la pompa, se si verifica una perdita). Impostazione della pressione massima: 4.000 psi (questo per proteggere la pompa dalla rottura, se si forma uno zoccolo). Premere “zero” sul pannello frontale del rilevatore per impostare lo spazio vuoto (lo spazio vuoto è la fase mobile pura). Risciacquare una siringa da 100 μL con acqua deionizzata, quindi con diversi volumi di uno degli standard di lavoro da analizzare, e riempire la siringa con quella soluzione. Inizia con i 3 campioni monocomponenti, che consentono di identificare il picco di ciascun componente di interesse. 5. Iniezione manuale del campione e della raccolta dei dati Con la maniglia dell’iniettore in posizione di carico, iniettare lentamente 100 μL di soluzione attraverso la porta del setto. Verificare che il programma di raccolta dati sia impostato per raccogliere dati per 300 s, il che consente tempo sufficiente affinché tutti e 3 i picchi eluino attraverso il rilevatore. Quando si è pronti per iniziare la prova, ruotare la maniglia dell’iniettore nella posizione di iniezione (che inietta il campione nella fase mobile) e fare clic su “Avvia prova” sul programma di raccolta dati del computer immediatamente. Per gli standard 1-3, solo uno dei tre picchi sequenziali viene visualizzato sullo schermo durante l’esecuzione (Figura 1). Una volta trascorsi 300 s, la raccolta dati invia una richiesta per salvare il file di dati. Salvare i dati con un nome di file adatto(ad esempio,STD#1). Prendere nota del tempo in secondi per il picco di ogni prova, che viene utilizzato per identificare quel componente. Rimuovere la siringa dal setto e ripetere il processo per ciascuno degli standard di lavoro rimanenti, utilizzando lo stesso tempo per cromatogramma determinato dalla prima esecuzione. Figura 1. Il cromatogramma dei 3 componenti. Da sinistra a destra, sono caffeina, aspartame e benzoato. 6. I campioni di bibite dietetiche Diet Coke, Diet Pepsi e Coke Zero sono le “incognite”. Sono stati lasciati fuori in contenitori aperti durante la notte per sbarazzarsi della carbonatazione, poiché le bolle non sono buone per il sistema HPLC. Questo elimina sufficientemente tutti i gas nei campioni. Aspirare circa 2 ml di soda dietetica in una siringa di plastica. Attaccare la punta del filtro alla siringa tramite Luer-Lok ruotandola in posizione. Spingere il liquido nella siringa attraverso il filtro e in un piccolo flaconcino di vetro. Questo elimina le particelle indesiderate che potrebbero potenzialmente ostruire la colonna di separazione. Diluire ogni campione con una quantità uguale di acqua DI, in modo che siano al 50% di purezza. Iniettare 100 μL del campione nel ciclo del campione ed eseguire prove con gli stessi parametri degli standard. 7. Calcoli Dalle concentrazioni delle soluzioni dei componenti, calcolare la concentrazione di tutti i componenti negli standard, in base alle diluizioni effettuate per i 7 campioni. Determinare le aree di picco sui cromatogrammi per ciascun campione standard e sconosciuto con il metodo triangolare, che equivale all’altezza del picco volte la larghezza a 1/2 altezza (Figura 2). Dopo aver determinato quale picco corrisponde a ciascun componente in base al tempo necessario a ciascun componente per mostrare il rispettivo picco, inserisci queste aree di picco in un foglio di calcolo del computer. Creare curve di calibrazione dell’area di picco rispetto alla concentrazione (mg/L) negli standard per tutti e tre i componenti. Determinare i minimi quadrati adatti a ciascuna curva di calibrazione. Calcola la concentrazione di ciascun componente nelle bibite dietetiche dalle aree di picco mostrate dagli studi HPLC per i campioni. Ricorda che la soda dietetica è stata diluita di un fattore 2 prima di essere iniettata nel sistema HPLC. Calcolare la quantità, in mg/L, di ogni componente delle bibite dietetiche. Sulla base dei risultati, calcolare i milligrammi di ciascun componente trovato in una lattina di soda da 12 once. Supponiamo 12 oz = 354,9 ml. Figura 2. Un esempio di base dell’altezza e della larghezza di picco di una curva, che devono essere moltiplicate (altezza di picco per larghezza a 1/2 altezza).

Results

The HPLC chromatograms are able to quantify each of the 3 components for all the samples based upon the calibration curves of the standards (Figure 3).

From this set of experiments, it was determined that a 12-oz can of these diet sodas contained the following amounts of each component:

Diet Coke: 50.5 mg caffeine; 217.6 mg aspartame; 83.6 mg benzoate.
Coke Zero: 43.1 mg caffeine; 124.9 mg aspartame; 85.3 mg benzoate.
Diet Pepsi: 34.1 mg caffeine; 184.7 mg aspartame; 79.5 mg benzoate.

Not surprisingly, all 3 had roughly the same amount of benzoate, as it is just a preservative. The Coke products had a bit more caffeine, and the Coke Zero had much less aspartame than the other two sodas, as it also includes citric acid for some flavoring.

The following numbers are the actual amounts of caffeine and aspartame in a 12-oz can of the 3 diet sodas (The caffeine content was obtained from the Coca-Cola and Pepsi websites. The aspartame content was obtained from both LiveStrong.com and DiabetesSelfManagement.com.):

Diet Coke: 46 mg caffeine; 187.5 mg aspartame
Coke Zero: 34 mg caffeine; 87.0 mg aspartame
Diet Pepsi: 35 mg caffeine; 177.0 mg aspartame

Sample Calculations (Table 2):

Concentration of caffeine in STD#1: The component solution for caffeine had 0.400 g of caffeine diluted to 500 mL = 0.500 L → 0.800 g/L = 0.800 mg/mL.

STD#1 had 1 mL of this solution diluted to 50.0 mL
0.800 mg/mL * (1.0 mL / 50.0 mL) = 0.016 mg/mL = 16.0 mg/L.

STD#2 had 2 mL of this solution diluted to 50.0 mL
0.800 mg/mL * (2.0 mL / 50.0 mL) = 0.032 mg/mL = 32.0 mg/L.

The results from the three calibration graphs (Figure 4) yielded the following equations:

Caffeine Peak Area = 0.1583*[Caffeine mg/L] – 0.574
Aspartame Peak Area = 0.02696*[Aspartame mg/L] – 0.405
Benzoate Peak Area = 0.1363*[Benzoate mg/L] – 1.192

Diet Coke: Caffeine Peak Area = 10.68 = 0.1583*[Caffeine mg/L] – 0.574

[Caffeine mg/L] = (10.68 + 0.574)/ (0.1583) = 71.1 mg/L in the injected sample.

Since the sample was diluted by a factor of 2, the Diet Coke had 141.2 mg/L caffeine.

The amount per 12-oz can = (141.2 mg/L)(0.3549 mL/12-oz can) = 50.5 mg caffeine/can.

Figure 3. The HPLC chromatograms of the 5 standards and the 3 samples.

Figure 4. The calibration curves for each of the 3 components.

Table 2. The data tables for the HPLC trials used for generating the calibration curves.

Applications and Summary

HPLC is a widely-used technique in the separation and detection for many applications. It is ideal for non-volatile compounds, as gas chromatography (GC) requires that the samples are in their gas phase. Non-volatile compounds include sugars, vitamins, drugs, and metabolites. Also, it is non-destructive, which allows each component to be collected for further analysis (such as mass spectrometry). The mobile phases are practically unlimited, which allows changes to the polarity of pH to achieve better resolution. The use of gradient mobile phases allows for these changes during the actual trials.

There has been concern over the possible health issues that may be associated with the artificial sweetener aspartame. Current product labeling does not show the amount of these components inside of the diet beverages. This method allows for quantifying these amounts, along with the caffeine and benzoate.

Other applications include determining the amounts of pesticides in water; determining the amount of acetaminophen or ibuprofen in pain reliever tablets; determining whether there are performance-enhancing drugs present in the bloodstream of athletes; or simply determining the presence of drugs in a crime lab. While the concentrations of these samples, and often the identity of the components, can be readily determined, the one limitation is that several samples could have close to identical retention times, resulting in co-eluting.

成績單

High-performance liquid chromatography, or HPLC, is a highly versatile technique that separates components of a liquid mixture based on their different interactions with a stationary phase.

HPLC is an adaptation of column chromatography. In column chromatography, a column is packed with micro-scale beads called the stationary phase. The stationary phase beads are functionalized with chemical groups that induce an interaction between the bead and the components of a mixture located in the liquid, or mobile phase. As the mixture flows through the column, the components interact with the stationary phase differently.

In HPLC, column chromatography is performed at a higher flow rate, and therefore higher pressure, than classical column chromatography. This enables the use of smaller stationary phase beads with a greater surface area to volume ratio, which greatly increases the interaction of the stationary phase and components in the mobile phase.

This video will introduce the basics of the operation of HPLC by demonstrating the separation of components of various diet sodas.

There are two types of HPLC used in the laboratory: analytical, and preparative. In analytical HPLC, the instrument is used to identify components of a small volume, and the analyzed sample is then discarded as waste. In preparative HPLC, the instrument is used to purify a mixture and a desired amount of each component is collected in fractions.

The HPLC instrumentation consists of a series of simple components. First, the mobile phase, held in solvent reservoirs, is pumped through the system by one or more pumps at a constant flow rate. The sample is injected into the mobile phase stream by the sample injector. The sample, diluted by the mobile phase, is then delivered to the HPLC column, where the components of the sample are separated. The components are then analyzed by the detector, and either saved in fractions for later use, or transferred to a waste bottle.

The HPLC column is the key component to the system. It is composed of a metal or plastic cylinder, packed with micro-scale beads of stationary phase, or chromatography resin. The sample mixture flows through the packed particle bed at a constant flow rate and each component interacts with the stationary phase as it flows by.

The compounds interact with the stationary phase differently, and therefore travels down the length of the column to the detector at a different rate. The time required for a component to exit the column, or elute, is called the retention time. The result is a plot of retention time vs. intensity, or a chromatogram. The retention time is used to identify the component. The peak size, specifically the area under the peak, is used to quantify the amount of the compound in the initial solution.

The choice of stationary phase depends on the properties of the components in the sample mixture. The most commonly used stationary phase is silica beads, as they are an inert nonpolar material that forms micro-scale beads, and achieves sufficient packing density. The most common type of HPLC is reversed-phase chromatography, which utilizes a hydrophobic stationary phase, typically silica beads with C18 chains bonded to the beads’ surface. The components are eluted in order of decreasing polarity.

The mobile phase used in reversed-phase chromatography is typically a mixture of water and an organic solvent, such as acetonitrile. Depending on the sample, the mobile phase can remain a constant ratio of water and organic solvent, known as isocratic mode. However, this can lead to broad peaks, in the case of high water content, or overlapping peaks—in the case of high organic content.

The mobile phase ratio can also be changed linearly or stepwise during the separation, to create a mobile phase gradient. A gradient elution can prevent peak broadening of the less polar components, thereby improving the separation and shortening the elution time.

Now that the basics of HPLC have been outlined, the HPLC technique will be demonstrated in the laboratory. In this experiment, HPLC will be used to separate and quantify three common components of diet soda.

First, to prepare the mobile phase, add 400 mL of acetonitrile to 1.5 L of purified deionized water. Then carefully add 2.4 mL of glacial acetic acid. Dilute the solution to a total volume of 2 L. The resulting solution should have a pH between 2.8 and 3.2.

Adjust the pH to 4.2 by adding 40% NaOH, drop-wise to the stirring solution, with the use of a calibrated pH meter.

Filter the mobile phase through a 0.47-μm membrane filter under vacuum to degas the solution and remove solids that could plug the column. It is important to degas the solution, as bubbles can cause voids in the stationary phase, or work their way to the detector cell and cause instability in measurements.

Prepare three component solutions of caffeine, benzoate, and aspartame, which are three typical components of diet sodas. These component solutions are then used to prepare the standard solutions that will be utilized to determine the unknowns. Prepare 500 mL of the caffeine and benzoate solutions.

Prepare 100 mL of the aspartame component solution. Store the solution in the refrigerator when not in use to avoid decomposition.

Next, prepare 7 standard solutions, each with different concentrations of caffeine, benzoate, and aspartame. Pipet the proper amount of each component into a volumetric flask, and dilute to the 50-mL mark with mobile phase.

The first 3 solutions each contain one component, to enable peak identification. The other 4 solutions contain a range of concentrations of all 3 components, in order to correlate peak height to concentration.

Pour each standard solution into a labeled vial in a sample rack. Store the sample rack with samples and the remaining solutions in the refrigerator.

First, set up the mobile phase and waste containers. Ensure that the waste lines are fed into a waste container, and are not recycling back into the mobile phase. Ensure that the inlet mobile phase line is fed into the mobile phase container.

Verify that the flow rate of the mobile phase is set to 0.5 mL/min. This flow rate will enable all components to elute within 5 min, but is slow enough to ensure resolution of individual peaks.

Next, verify the minimum and maximum pressures on the solvent delivery system. These settings shut the pump off in case of a leak or clog, respectively.

Press “zero” on the detectors front panel, to set the blank. Rinse a 100-μL syringe with deionized water, then with several volumes of 1 of the 7 working standards. Then fill the syringe with that solution. Begin with the 3 single-component samples in order to identify the peak of each component.

Next, manually inject the solution, by placing the injector handle in the load position. Slowly inject the 100 μL of solution through the septum port.

Verify that the data collection program is set to collect data for 300 s, which allows for enough time for all 3 peaks to elute through the detector. When ready to begin the trial, rotate the injector handle to the inject position, in order to inject the sample into the mobile phase. Immediately, click “Start Trial” on the data collection program. When the scan is complete, repeat the process for each of the 7 standard solutions. For each of the first 3 standards, only one of the 3 peaks appears. Note the location of the peak, which is used to identify the component.

Select 3 diet soda samples, and allow them to sit out in open containers overnight to remove the carbonation.

After overnight degassing, draw approximately 3 mL of each diet soda into a plastic syringe. Next, attach a filter tip to the syringe and push the soda through the filter into a glass vial, in order to remove any solid particulates.

Dilute 2 mL of each sample with 2 mL of the mobile phase to decrease the soda concentration by half.

Draw 100 μL of one of the soda samples into a syringe, and inject it into the sample loop. Run the trial with identical parameters to the standard solutions. Repeat for each soda sample.

First, correlate the peak areas of the standard samples to the known concentrations. To do so, determine the peak areas on the chromatographs for each standard sample using the triangular method. Calculate the peak height times with the width at half of the height, and use this value as the peak area.

Using the peak area and known concentrations create a calibration curve for each component, and determine the least-squares fit for each calibration curve.

Calculate the concentration of each component in the diet sodas from the peak areas. Remember that the sodas were all diluted by a factor of 2 prior to injection into the HPLC. Based on these results, calculate the mg of each component in a 12-oz can of soda.

Unsurprisingly, all 3 sodas tested contained roughly the same amount of the preservative benzoate. However, the Coke products contained more caffeine. The calculated values for all components correlated well to reported values by the manufacturers.

HPLC is a highly versatile instrument, which is used in a wide range of analyses.

HPLC is often used to purify peptide molecules. In this example, transmembrane peptide complexes were prepared, and then stabilized by oxidative crosslinking the proteins with disulfide bonds.

The proteins were then dissolved in formic acid, and purified using reversed phase HPLC. The sample was then eluted using a linear gradient of two solvents, and the purity confirmed with mass spectrometry.

HPLC can also be used to identify organic compounds synthesized in the lab. In the Miller-Urey experiment, the abiotic synthesis of organic compounds on primordial earth was studied. Primordial gases, such as methane and ammonia, were introduced to a flask containing water, simulating early oceans. Electrical discharge was then applied, imitating lightning on primordial earth.

The water was then analyzed using HPLC coupled with mass spectrometry, and compared to known amino acid standards. 23 amino acids were synthesized and identified in this experiment.

You’ve just watched JoVE’s introduction to HPLC. You should now understand the basics of running the instrument, and analyzing the resultant data.

Thanks for watching!

Cite This

JoVE Science Education Database. JoVE Science Education. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). JoVE, Cambridge, MA, (2023).