Summary

Preparando um modelo de camundongos de pancreatite aguda grave por meio de uma combinação de injeção intraperitoneal de ceruleína e lipopolissacarídeo

Published: May 10, 2024
doi:

Summary

A administração intraperitoneal de medicamentos é uma abordagem não invasiva segura e eficaz para induzir lesão pancreática. Este estudo comparou cinco protocolos distintos de injeção intraperitoneal em camundongos para induzir graus variados de lesão pancreática e estabeleceu um modelo de lesão pancreática grave para investigar as alterações patológicas e estratégias de tratamento para pancreatite aguda grave (SAP).

Abstract

O tratamento da pancreatite aguda grave (PAS), com altas taxas de mortalidade, representa um desafio clínico significativo. Investigar as alterações patológicas associadas à SAP usando modelos animais pode ajudar a identificar potenciais alvos terapêuticos e explorar novas abordagens de tratamento. Estudos anteriores induziram principalmente lesão pancreática por meio da injeção retrógrada do ducto biliar de taviaurocolato de sódio, mas o impacto do dano cirúrgico na qualidade do modelo animal permanece obscuro. Neste estudo, empregamos várias frequências de injeções intraperitoneais de caeruleína combinadas com diferentes doses de LPS para induzir lesão pancreática em camundongos C57BL / 6J e comparamos a extensão da lesão em cinco protocolos de injeção intraperitoneal. Em relação à indução de pancreatite aguda em camundongos, é proposto um protocolo de injeção intraperitoneal que resulta em uma taxa de mortalidade de até 80% em 5 dias. Especificamente, os camundongos receberam dez injeções intraperitoneais diárias de Caerulein (50 μg / kg), seguidas por uma injeção de LPS (15 mg / kg) uma hora após a última administração de Caerulein. Ao ajustar a frequência e a dosagem dos medicamentos injetados, pode-se manipular a gravidade da lesão pancreática de forma eficaz. Este modelo apresenta forte controlabilidade e tem um ciclo de replicação curto, tornando-o viável para conclusão por um único pesquisador sem a necessidade de equipamentos caros. Ele simula de forma conveniente e precisa as principais características da doença observadas na SAP humana, demonstrando um alto grau de reprodutibilidade.

Introduction

A pancreatite aguda grave é caracterizada por início rápido, progressão rápida e altas taxas de mortalidade no domínio1 da doença do sistema digestivo. Sua alta taxa de mortalidade sempre foi um foco proeminente da pesquisa clínica. Devido a mudanças imprevisíveis nas condições clínicas, heterogeneidade das manifestações da doença e disponibilidade limitada de espécimes humanos, o estabelecimento de modelos animais tornou-se cada vez mais crucial para a pesquisa de doenças.

A injeção retrógrada de taurocolato de sódio no ducto colédoco comum é comumente usada para criar um modelo de SAP2 em ratos. Ao simular a obstrução pancreatobiliar e induzir o refluxo da bile e do líquido pancreático, essa técnica de modelagem exibe uma alta taxa de sucesso na replicação de modelos animais SAP. No entanto, deve-se notar que a cirurgia invasiva tem impacto no próprio modelo animal. Além disso, este método é limitado a animais maiores, como ratos e cães, que são usados principalmente como sujeitos experimentais. Técnicas alternativas, incluindo intubação duodenal3, punção duodenal direta4 e punção direta do ducto biliar-ducto pancreático5, são frequentemente utilizadas para fins de modelagem.

Os métodos de injeção intraperitoneal e modelagem dietética oferecem vantagens não invasivas que podem ser aplicadas a animais de qualquer tamanho. O modelo de camundongo de SAP induzido pela alimentação com etionina deficiente em colina (CDE)6 apresenta algumas complicações, como hiperglicemia e hipocalcemia pouco controláveis, tornando-o inadequado para avaliar novas abordagens diagnósticas e terapêuticas. Por outro lado, a injeção intraperitoneal de Caerulein combinada com L-arginina7 representa o método mais comumente empregado para induzir pancreatite aguda em camundongos. Especificamente, a administração intraperitoneal repetida de Caeruleína – um análogo da colecistocinina – fornece uma abordagem altamente adequada para investigar vários aspectos relacionados a essa doença destrutiva, incluindo patogênese, inflamação e processos de regeneração. Devido à sua semelhança estrutural com a colecistocinina (CCK), a ceruleína estimula efetivamente a contração da vesícula biliar e a secreção enzimática pancreática, levando a um desequilíbrio na secreção enzimática seguido de subsequente autodestruição8. O lipopolissacarídeo (LPS), sendo onipresente e extensivamente estudado como uma molécula de padrão molecular associada a patógenos, pode ser combinado com Caeruleína via injeção intraperitoneal para estabelecer um modelo eficaz de SAP em camundongos. Essa combinação desencadeia e libera rapidamente um número significativo de citocinas inflamatórias, resultando em inflamação local e sistêmica excessiva. Vários estudos relataram a indução de modelos SAP em camundongos por meio da injeção intraperitoneal de Caeruleína combinada com LPS. Isso pode ser atribuído ao fato de que a injeção intraperitoneal de ceruleína pode causar edema pancreático e hemorragia em camundongos, enquanto a adição de LPS pode induzir imediatamente necrose pancreática e exacerbar a resposta inflamatória sistêmica, sepse e até falência de órgãos. Atualmente, há variação na dosagem e frequência de injeções intraperitoneais de caeruleína, bem como inconsistência na dosagem adicional de LPS. Alcançar consistência em modelos SAP de mouse é um desafio 9,10,11,12; Portanto, é necessário estabelecer um protocolo padronizado para a obtenção de um modelo ideal. Neste artigo, descrevemos um protocolo para injeção intraperitoneal em camundongos e investigamos a frequência ideal de injeção e dosagem adicional de LPS.

Protocol

Este protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui (Huainan, China) (Código de Ética: 2023-KY-905-001). O estudo seguiu as diretrizes do National Institutes of Health para o cuidado e uso de roedores de pesquisa em todos os procedimentos com animais. Camundongos adultos C57BL/6J pesando 20-30 g foram usados para o presente estudo. Os camundongos foram alojados em um laboratório animal por uma semana sob condições controladas (…

Representative Results

O processo de modelagem experimental de camundongos é ilustrado na Figura 1. Após 12 h do término da injeção, um gravador de vídeo de campo aberto foi usado para monitorar a distância de movimento e a duração da imobilidade de diferentes grupos experimentais de camundongos por 5 ciclos (Figura 2A). Durante os 5 ciclos, os camundongos do grupo PI V mantiveram um baixo nível de distância de movimento em 3 minutos, enquanto a taxa de imo…

Discussion

Atualmente, faltam meios eficazes para melhorar a alta taxa de mortalidade em pacientes com pancreatite aguda grave. É crucial investigar a eficácia dos medicamentos no aumento dos mecanismos de estabilidade imunológica. Existe uma necessidade urgente de um modelo animal ideal para pancreatite aguda grave. Camundongos com histórico genético C57BL/6J são amplamente utilizados em pesquisas biomédicas, incluindo estudos sobre fisiopatologia SAP. Mais de 70 anos de diferenciação genética em camundongos B6J resultar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado por Projetos de Pesquisa em Saúde e Ciências Médicas na cidade de Huainan (No. HNWJ2023005); Programa do Plano Municipal de Ciência e Tecnologia na Cidade de Huainan (No.2023151); Programa de Treinamento em Inovação e Empreendedorismo para Estudantes do Colégio Provincial de Anhui (nº S202310361254); O nono lote do “50 · Estrelas da Ciência e Tecnologia” na cidade de Huainan e no Projeto de Construção de Especialidades Clínicas Chave da Província de Anhui. Gostaríamos de expressar nossa gratidão ao Departamento de Laboratório do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui por fornecer os dados de teste relevantes.

Materials

20× Citric Acid Antigen Repair Solution (pH 6.0) Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G1202-250 ml
Amylase Mindray,China
Annexin V-FITC/PI Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China  G1511   diluted at 1:20
Anti-HMGB1 Rabbit pAB Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China GB11103   diluted at 1:1800
BCA protein quantitative detection kit Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G2026-200T
BD FACSCanto II Flow Cytometer BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA BD FACSCanto II
BSA Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China GC305010-100g
C57BL/6J Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, China license number SCXY (Su) 2011–0003
Ceruletide  MCE, New Jersey, USA 17650-98-5  50 µg/kg
Chemiluminescence imager Cytiva CO.,LTD.;USA
Citric acid antigen repair Solution (Dry powder pH 6.0) Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G1201-5 L
Collagenase IV Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China  GC305014 0.5 mg/mL
DAB (SA-HRP) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G1507-100 T
Dimension EXL with LM Integrated Chemistry System Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,USA YZB/USA 8311-2014
ECL developer Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China
Eosin dye (alcohol soluble) Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G1001-100 ml
EthoVision XT  Noldus, Netherlands
FITC-labeled goat anti-rabbit IgG Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China GB22303   diluted at 1:50
Fully automatic blood cell analyzer Zybio Inc. China  Zybio-Z3 CRP
GapDH Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China GB11103   diluted at 1:1500
Hematoxylin blue return solution Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G1040-500 ml
Hematoxylin differentiation solution Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G1039-500 ml
Hematoxylin dye Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G1004-100 ml
HMGB-1 ELISA kits njjcbio Co., Ltd, China
HOMOGENIZER Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China KZ-III-F;IC111150 100222
HRP-labeled goat anti-rabbit IgG Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China GB23303   diluted at 1:1500
IL-6 ELISA kits Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China GEM0001
Lipase  Mindray,China
Lipopolysaccharide  Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China GC205009 15 mg/kg
Low temperature high speed centrifuge Changsha Pingfan Apparatus&Instrument Co.,Ltd.,China TGL-20M
Membrane breaking liquid Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G1204
microtome Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;China CR-601ST
Nylon mesh Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China 200-mesh
One-step TUNEL cell apoptosis detection kit (DAB staining method) Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G1507-100T
Paraffin tissue embedding machine PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China PBM-A
Pathological tissue drying apparatus PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;Changzhou,China PHY-III
Phosphate-buffered saline Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G4202-100ML
PMSF Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G2008-1 ml
Positive fluorescence microscope Olympus Corporation,Tokyo, Japan BX53
Pro Calcitonin Mindray,China
PVDF membrane Millipore, USA 0.22 µm
RIPA Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China G2002-100 ml
SDS-PAGE Beyotime Biotechnology,China P0012A
TNF-αELISA kits Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, China GEM0004
Ultrasonic water bath DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO.,LTD.;China KQ-200KDE
Western Blot Bio-Rad Laboratories, Inc.,USA
Western blot imaging System Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPAN Amersham ImageQuant 800 
Whirlpool mixer SCILOGEX;USA

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Xu, L., Xu, M., Xie, Y., You, W., Wang, J., Xu, L., Feng, Q., Sun, J., Zhang, J., Yang, H., Qi, W. Preparing a Mice Model of Severe Acute Pancreatitis via a Combination of Caerulein and Lipopolysaccharide Intraperitoneal Injection. J. Vis. Exp. (207), e66780, doi:10.3791/66780 (2024).

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