Kwantificering van microgliale inslokking van synaptisch materiaal met behulp van flowcytometrie

Een algemeen overzicht van de experimentele procedure wordt grafisch geïllustreerd in figuur 1A. Alle gebruikte experimenten met betrekking tot het hanteren van levende dieren werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Duitse wet op de dierenbescherming en werden goedgekeurd door het regionale bureau voor gezondheids- en sociale diensten in Berlijn (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlijn, Duitsland). De muizen werden gehuisvest in geventileerde kooien onder standaard laboratoriumomstandigheden met een licht/donkercyclus van 12:12 uur in de dierkernfaciliteit van het Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC). Voedsel en water werden ad libitum verstrekt. Zie Tabel 1 voor de samenstelling van buffers en reagentia en de Tabel met materialen voor details met betrekking tot alle reagentia, instrumenten en materialen die in dit protocol worden gebruikt. Voor de vGLUT1-specifieke test gebruikten we de term in vivo* in het hele manuscript om te erkennen dat flowcytometrie weefselhomogenisatie en celisolatie vereist, en dat microglia ongeveer 95% levensvatbaarheid vertonen na de isolatieprocedure (Figuur 1B en aanvullende figuur S1). Daarom behouden ze hun vermogen om synaptisch materiaal ex vivo op te slokken, gedurende een korte periode, tot de fixatie. De kwantificering van vGLUT1+ microglia omvat dus zowel in vivo als ex vivo slokatie op korte termijn tot aan de fixatiestap. 1. Intracellulaire vGLUT1-kleuring voor de detectie van in vivo* inslokking van glutamaterge synapsen door microglia OPMERKING: De volgende procedure voor celisolatie is aangepast van16. Alle stappen van celisolatie moeten op ijs worden uitgevoerd. Verdoof de muizen met behulp van intraperitoneale injectie van pentobarbital. Doordrenk de muizen intracardiaal met 10 ml ijskoude Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) gedurende ~2 min.OPMERKING: Per monster (n) wordt één muis gebruikt. Haal de hersenen uit de schedel en bewaar ze in 1 ml neuraal celmedium.OPMERKING: Neuraal celmedium, zoals Hibernate-A-medium, wordt gebruikt om een hoge levensvatbaarheid van cellen te garanderen na het weefseldissociatieproces. Breng de hersenen over naar een petrischaal gevuld met 1 ml ijskoud neuraal celmedium en ontleed de hippocampi zoals eerder beschreven17. Breng de hippocampi over naar een Dounce-homogenisator gevuld met 1 ml neuraal celmedium en dissocieer het weefsel met behulp van de losse stamper met ongeveer ~ 25 zachte bewegingen. Plaats een zeef van 70 μm op een buis van 5 ml polypropyleen en voeg 500 μl neuraal celmedium toe. Breng het weefselhomogenaat over naar de polypropyleen buis van 5 ml door de zeef. Spoel de Dounce homogenisator 2x met 1 ml koud neuraal celmedium en centrifugeer de monsters op 400 × g gedurende 8 min. Aspireer het supernatans en resuspendeer de pellet in 500 μl ijskoud DPBS via zacht pipetteren. Zorg voor een homogene suspensie en vul het uiteindelijke volume aan tot 1,5 ml met behulp van DPBS. Voeg 500 μL isotone Percoll-oplossing toe aan het monster, resuspendeer het voorzichtig en bedek het met nog eens 2 ml koud DPBS. Centrifugeer de monsters bij 3.000 × g gedurende 10 minuten met volledige acceleratie en zonder rem. Zuig zowel de bovenste laag als de myelineschijf op in de middelste fase.NOTITIE: Alle volgende centrifugeerstappen worden uitgevoerd bij 4 °C, tenzij anders aangegeven. Voeg 4 ml koude DPBS toe en centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 400 × g . Zuig het supernatans op en resuspendeer de cellen in 100 μl fixeerbare levensvatbaarheidskleuringsoplossing en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 4 °C. Voeg 1 ml koude DPBS toe aan het monster en centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 300 × g . Gooi het supernatans weg en voeg 100 μl CD16/CD32-kleuringsoplossing toe (1/200 in FACS-buffer). Vortex gedurende ~5 s en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.OPMERKING: CD16/CD32-kleuring is een voorbehandeling om niet-specifieke binding van antilichamen aan FcR-dragende cellen, zoals microglia, voorafgaand aan toepassingen zoals flowcytometrie te minimaliseren. Voeg 1 ml FACS-buffer toe aan het monster en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g . Aspireer het supernatans en voeg 100 μL kleuringsmastermix-I toe (1/100 anti-CD11b/ anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C/ anti-Ly6G in 1x FACS Buffer). Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 4°C in het donker. Voeg 1 ml FACS-buffer toe aan het monster en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g . Resuspendeer de pellet in 250 μL fixatiebuffer. Incubeer bij 4 °C gedurende 25 min. Voeg 2 ml 1x permeabilisatie (PERM) Buffer toe en centrifugeer 300 × g gedurende 5 min. Gooi het supernatans weg en voeg 100 μl vGLUT1 of isotypecontrolekleuringsoplossing toe. Vortex gedurende ~5 s en incubeer de monsters bij 4 °C gedurende 50 min. Voeg 2 ml 1x PERM Buffer toe en centrifugeer 300 × g gedurende 5 min. Gooi het supernatans weg en voeg 2 ml FACS-buffer toe aan de monsters. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in 250 μL FACS-buffer en leid de monsters door een zeeffilter van 40 μm. Analyseer de vGLUT1-fluorescentie-intensiteit van enkele/levensvatbare/CD11b++/CD45+ microglia met behulp van flowcytometrie. Gebruik miltmacrofagen als negatieve controle voor elk experiment.Isoleer splenocyten door fijngehakt miltweefsel twee keer voorzichtig door een zeeffilter van 70 μm te persen. Spoel de filters af met 40 ml DPBS en vang de suspensie op in een conische buis van 50 ml. Centrifugeer 350 × g gedurende 10 minuten en resuspendeer de resulterende pellet in een 1 ml oplossing van lysisbuffer voor rode bloedcellen. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Voeg na de incubatie 10 ml DPBS toe aan het monster en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 350 × g . Ga verder met de kleuringsstappen die tussen stap 1.11 en 1.17 worden uitgelegd.OPMERKING: De gating-strategie is opgenomen in aanvullende figuur S2 om miltmacrofagen te definiëren als CD11b ++/ CD45 ++/ Levensvatbare celpopulatie. Gating-strategie (Figuur 1)Primaire poort: Pas het voorwaartse verstrooiingsgebied (FSC-A) [x-as] en het zijverstrooiingsgebied (SSC-A) [y-as] aan om de microgliapopulatie in het omheinde gebied op te nemen en het cellulaire puin uit te sluiten. Pas het voorwaartse verstrooiingsgebied (FSC-A) [x-as] en de voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H) [y-as] aan om doubletten uit te sluiten. Singlets worden weergegeven als een diagonaal op deze stippenteken. Pas CD11b-PECy7 [y-as] en CD45-APC [x-as] aan en poort de populatie met een hoog oppervlakteniveau van CD11b en een gemiddeld niveau van CD45 als microglia. Sluit dode cellen in de FITC[y-as] negatieve poort uit. OPTIONEEL: Sluit ook cellen uit die positief zijn voor Ly6C- en Ly6G-FITC in de FITC-negatieve poort om CZS-geassocieerde macrofagen uit te sluiten van de analyse.OPMERKING: In tegenstelling tot levende cellen, zorgen dode cellen met gecompromitteerde membranen ervoor dat de fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof het cytoplasma binnendringt, waardoor de hoeveelheid eiwitetikettering toeneemt18. Dode cellen zullen dus helderder zijn dan levende cellen, die zijn opgenomen in de gedefinieerde poort. Pas CD45-APC [x-as] en vGLUT1-PE [y-as] aan; de populatie die zich boven de drempelpoort bevindt, waarbij er geen positieve gebeurtenissen zijn gedetecteerd in het miltmonster (interne biologische negatieve controle, figuur 1E) wordt beschouwd als de vGLUT1-positieve fractie in het monster. 2. Detectie van in vitro inslokking van ruwe synaptosomen door microglia Ruwe synaptosoombereiding en pHrodo Red-etiketteringOPMERKING: Alle volgende stappen moeten op ijs plaatsvinden.Volg de stappen 1.1 tot en met 1.2. Breng de hersenen over naar een petrischaal gevuld met 1 ml ijskoud neuraal celmedium en ontleed de hippocampi zorgvuldig. Bewaar de petrischaal altijd op ijs. Gebruik hippocampi voor microglia-isolatie in de volgende stap. Breng de rest van de hersenen (met uitzondering van het cerebellum en de bulbus olfactorius) over naar een Dounce-homogenisator gevuld met 1 ml synaptisch eiwitextractiereagens en dissocieer het weefsel voorzichtig met behulp van de losse stamper met ongeveer ~30 slagen. Vul de proteaseremmer van één tablet per 10 ml van het extractiereagens aan en isoleer de synaptosomen volgens de instructies van de fabrikant.OPMERKING: Synaptische eiwitextractiereagentia, zoals SynPER19, worden gebruikt om synaptosomen te bereiden die biologisch actieve pre- en postsynaptische eiwitten bevatten. Los de ruwe synaptosoomkorrel op in 500 μl 0,1 M Na2CO3 -oplossing. Kleur het synaptosoommonster met 10 μL 0,2 mM pHrodo Rood. Incubeer de ruwe synaptosoommonsters bij kamertemperatuur (24-25 °C) gedurende 1,5 uur met zachte agitatie. Voeg 1 ml koude DPBS toe aan het monster, centrifugeer gedurende 1 minuut op volle snelheid (20.815 × g) en zuig het supernatant op. Herhaal stap 2.1.5 in totaal 7x om ongebonden overmatig pHrodo Rood uit de monsters te verwijderen. Voer na de laatste centrifuge een standaard BCA-test uit om de eiwitconcentraties van het monster te kwantificeren. Optioneel: klik de synaptosoommonsters in DPBS met 5% DMSO in met vloeibare stikstof en bewaar ze gedurende 3 weken bij -80 °C. Dek de buizen af met aluminiumfolie om de blootstelling aan licht tot een minimum te beperken. In vitro Ruwe synaptosoomoverspoelingstest met behulp van vers geïsoleerde microglia voor volwassenenBereid aCSF voor en breng het in evenwicht met 95% O2:5%CO2 gedurende 30 min.OPMERKING: Volg voor de stappen 2.2.2-2.2.4 de instructies van de fabrikant voor de bereiding van een verteringsoplossing op basis van papaïne. Voeg 4 ml aCSF toe aan injectieflacon 2 in de papaïneset. Plaats de injectieflacon in een waterbad van 37 °C gedurende ~10 minuten totdat de papaïneoplossing helder lijkt. Voeg 400 μL aCSF toe aan injectieflacon 3 in de papaïnekit. Meng voorzichtig gedurende ~10 keer door langzaam te pipetteren. Voeg 200 μl uit injectieflacon 3 toe aan injectieflacon 2 (gereconstrueerd in stap 2.2.3). Bewaar de rest van de injectieflacon 3. Neem de hippocampi die in stap 2.1.2 zijn ontleed en hak de ontlede hippocampi fijn met een scalpel. Breng de fijngehakte hippocampi over in een weefseldissociatorbuisje gevuld met 2 ml enzymoplossing bereid in stap 2.2.5. Plaats de buis in de weefseldissociator en voer het programma uit: 37C_ABDK_01 (duurt ~30 min). Plaats de monsters in een waterbad op 37 °C gedurende ~20 minuten en trituer het mengsel elke 5 minuten met een pipet van 1 ml zonder belletjes te maken.OPMERKING: Dit proces moet worden voortgezet totdat het weefsel volledig is gedissocieerd en volledig homogeen lijkt om een efficiënte dissociatie te garanderen. Alle volgende centrifugatiestappen worden uitgevoerd bij 4 °C, tenzij anders aangegeven. Verwijder de troebele celsuspensie voorzichtig in een nieuw buisje van 15 ml en centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten. Bereid gedurende deze periode van 5 minuten de volgende wasmix (5 ml) per monster; voeg 500 μl gereconstitueerde albumine-ovomucoïdremmeroplossing in de papaïnekit toe aan 4,5 ml aCSF. Voeg de resterende oplossing in injectieflacon 3 uit stap 2.2.5 toe aan de wasmix. Gooi het supernatans uit stap 2.2.8 weg en suspendeer de celkorrel onmiddellijk opnieuw in de wasmengoplossing. Breng het monster door een filter van 70 μm naar een nieuwe microcentrifugebuis van 5 ml. Centrifugeer de monsters bij 300 × g gedurende 5 minuten. Ga verder met de Percoll-gradiëntcentrifugatiestap die eerder is uitgelegd in stappen 1.7-1.9. Resuspendeer de cellen voorzichtig in de MACS-kleuringsbuffer door langzaam op en neer te pipetteren. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 4 °C. Voeg 1 ml MACS-buffer toe aan elk monster en centrifugeer bij 300 × g gedurende 8 minuten. Resuspendeer de cellen in 500 μL MACS-buffer. Plaats de positieve selectiekolommen in de magnetische scheider. Breng de kolommen in evenwicht door ze te spoelen met 3 ml MACS Buffer. Meng voorzichtig en breng 500 μL van de celsuspensie aan op de kolom. Was de kolommen 3x met 3 ml MACS Buffer. Verwijder de kolommen van de magnetische scheider en plaats ze op conische buizen van 15 ml. Voeg 5 ml MACS-buffer toe aan de kolom en spoel de cellen onmiddellijk weg met een plumper. Centrifugeer de monsters bij 300 × g gedurende 10 minuten. Bereid gedurende deze periode 20 ml 40% FBS in DPBS. Verwarm 1 ml DMEM per monster voor tot 37 °C in een waterbad. Los de uiteindelijke celkorrel op in 1 ml voorverwarmde DMEM. Zaad ongeveer ~150.000-200.000 cellen in 500 μL voorverwarmde DMEM per put in een plaat met 24 putjes. Zaai als controle een vergelijkbaar aantal cellen in 1-2 extra putjes. Controleer de samenvloeiing van cellen in alle putjes met behulp van een lichtmicroscoop.OPMERKING: Als het doelhersengebied de hippocampus of vergelijkbaar kleine hersengebieden is, kunnen 5 muizen per monster (n) worden samengevoegd om ~150.000 microglia te isoleren. Voor het hele brein is 1 muis per n voldoende om een vergelijkbaar aantal cellen te verkrijgen met behulp van beide isolatieprotocollen. Als alternatief kunnen ~40.000 cellen worden geplateerd in platen met 96 putjes in een eindvolume van 100 μL om de sloktest te starten. Dit vermindert het aantal geanalyseerde cellen, maar vermindert ook het aantal gebruikte muizen per n. Eiwitdeprivatie door gebrek aan FCS in DMEM zal fagocytose veroorzaken. Incubeer de plaat gedurende 1-2 uur in de incubator (37 °C en 5% CO2 ).OPMERKING: Deze stap is bedoeld om de cellen te laten herstellen van de stressgevoelige effecten van de isolatieprocedure voorafgaand aan de start van de functionele overspoelingstest. Haal heel langzaam 250 μl medium uit elk putje, voeg 250 μl vers voorverwarmd DMEM toe aan elk putje en voeg 3 μg pHRodo roodgelabelde synaptosomen toe aan de bovenkant. Controleer de samenvloeiing van cellen in alle putjes met behulp van een lichtmicroscoop.Voeg voor de negatieve controleputjes dezelfde hoeveelheid niet-gelabelde synaptosomen toe aan het extra goed bezaaide met cellen. Zorg er bij testputjes voor dat putje 1 alleen cellen bevat; WELL 2 bevat cellen+ niet-gelabelde synaptosomen; well-3 bevat cellen+ 3 μg pHrodo Rood; goed 4 bevat DMEM + 3 μg pHrodo Red. Incubeer de cellen met synaptosomen gedurende 2 uur in de incubator (37 °C en 5% CO2 ). Haal het medium eruit en was de kuiltjes met koud DPBS. Voeg 200 μL trypsine/EDTA-oplossing per putje toe om de cellen gedurende 35 s los te maken. Voeg 1 ml 40% FBS toe aan DPBS per putje en breng de cellen over in een polypropyleen buis van 5 ml door de zeef. Houd tijdens dit proces zowel de plaat als de buis op ijs om het loskomen van cellen te vergemakkelijken. Was elk putje 2x met 500 μL ijskoud DPBS. Centrifugeer de verzamelde monsters bij 500 × g gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cellen in de kleuringsoplossing met 1/200 CD16/CD32 in 100 μL FACS-buffer en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Voeg na de incubatie CD11b en CD45 toe aan de kleuroplossing met een eindconcentratie van 1/100 van elk. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 4 °C in het donker. Was de monsters met 1 ml FACS-buffer en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 300 × g . Resuspendeer de pellet in 250 μL FACS-buffer en registreer ten minste 100.000 totale events met behulp van flowcytometrie. Analyseer de pHrodo Rode fluorescentie-intensiteit van CD11b++/CD45+ microglia. Poortstrategie (Figuur 2C)Pas de primaire poort aan: Forward Scatter Area (FSC-A) [x-as] en Side Scatter Area (SSC-A) [x-as] om de microglia-populatie in het omheinde gebied op te nemen en het cellulaire puin uit te sluiten. Pas het voorwaartse verstrooiingsgebied (FSC-A) [x-as] en de voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H) [y-as] aan om doubletten uit te sluiten. Singlets worden weergegeven als een diagonaal op deze stippenteken. Pas CD11b-PECy7 [y-as] en CD45-APC [x-as] aan en poort de populatie met CD11b met een hoog oppervlak en een gemiddeld niveau van CD45 als microglia. Bereken de mediane fluorescentie-intensiteit van pHrodo-PE uit deze populatie. Gebruik dezelfde cellen die zijn uitgebroed met niet-gelabelde synaptosomen als de negatieve controle.