Ontwarren van glycaan-eiwitinteracties: nucleaire magnetische resonantie (NMR) om te redden
Summary
Hier presenteren we een protocol waarin de verwerving, verwerking en analyse van een reeks NMR-experimenten wordt beschreven die gericht zijn op het karakteriseren van eiwit-glycaaninteracties in oplossing. De meest voorkomende op liganden gebaseerde en op eiwitten gebaseerde methodologieën worden geschetst, die ongetwijfeld bijdragen aan de gebieden van structurele glycobiologie en moleculaire herkenningsstudies.
Abstract
De interacties van glycanen met eiwitten moduleren veel gebeurtenissen die verband houden met gezondheid en ziekte. In feite zijn het vaststellen van deze herkenningsgebeurtenissen en hun biologische gevolgen nauw verbonden met de driedimensionale structuren van beide partners, evenals met hun dynamische kenmerken en hun presentatie op de overeenkomstige celcompartimenten. NMR-technieken zijn uniek om deze kenmerken te ontwarren en er zijn inderdaad diverse op NMR gebaseerde methodologieën ontwikkeld en toegepast om de bindingsgebeurtenissen van glycanen met hun geassocieerde receptoren te volgen. Dit protocol schetst de procedures voor het verwerven, verwerken en analyseren van twee van de krachtigste NMR-methodologieën die worden gebruikt op het gebied van NMR-glycobiologie, 1H-Saturation Transfer Difference (STD) en 1 H,15N-Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) titratie-experimenten, die complementair informatie bieden vanuit respectievelijk het glycaan- en eiwitperspectief. Sterker nog, wanneer ze worden gecombineerd, bieden ze een krachtige toolkit voor het ophelderen van zowel de structurele als de dynamische aspecten van moleculaire herkenningsprocessen. Deze alomvattende aanpak vergroot ons begrip van glycaan-eiwitinteracties en draagt bij aan het bevorderen van onderzoek op het gebied van chemische glycobiologie.
Introduction
Moleculaire herkenning van glycanen is essentieel voor veel processen die verband houden met gezondheid en ziekte. De specificiteit en selectiviteit van biologische receptoren (lectines, antilichamen, enzymen) voor glycanen hangen sterk af van het aanpassen van het precaire evenwicht tussen de diverse componenten van enthalpie (CH-π en van der Waals, waterstofbruggen, elektrostatica) en entropie (hydrofobiciteit, dynamica, solvatie-desolvatie)1.
Gezien de grote chemische diversiteit en dynamische aard van glycanen, worden NMR-methoden al meer dan 25 jaar op grote schaal gebruikt om glycaaninteracties te ontleden2, aangezien deze methodologieën uitstekende informatie verschaffen over moleculaire herkenningsgebeurtenissen met nauwkeurige details, bij atomaire resolutie 3,4, zelfs wanneer het vereiste interactiebewijs niet kan worden verkregen door andere methodologieën te gebruiken. Als belangrijk punt is NMR veelzijdig en maakt het mogelijk om dynamische gebeurtenissen te bestuderen, op atomair niveau, op verschillende tijdschalen, wat verreweg de beste techniek is voor het bestuderen van de structuur, conformatie en dynamiek van glycanen in oplossing. Desalniettemin kan het ontrafelen van deze informatie een vrij complex proces zijn dat het gebruik van goed gedefinieerde strategieën vereist, in combinatie met een zorgvuldige gegevensanalyse5.
NMR-technieken zijn divers en er zijn inderdaad veel methodologieën die kunnen worden gebruikt om glycaan-eiwitinteracties te ontrafelen6. Hierin beschrijven we twee basisbenaderingen van NMR die momenteel worden gebruikt om glycaan-receptorinteracties te ontcijferen 7,8, waarbij de nadruk ligt op het ontwarren van de presentatie van het belangrijkste glycaanepitoop en de eiwitbindingsplaats9.
Bij elke moleculaire herkenningsgebeurtenis, wanneer een receptor zich bindt aan een bepaald ligand, is er een chemisch uitwisselingsproces dat veel NMR-parameters van de deelnemers aan de binding beïnvloedt10. Daarom kan de interactie vanuit het NMR-perspectief worden gevolgd vanuit het oogpunt van het glycaanligand of vanuit dat van de eiwitreceptor11. Over het algemeen is de eiwitreceptor een groot biomolecuul (langzame rotatiebeweging, met snelheden in de ns-tijdschaal, en dus snelle transversale relaxatie), terwijl het interagerende glycaan kan worden beschouwd als een klein tot middelgroot molecuul (snelle rotatiebeweging, met snelheden in de ps-tijdschaal en langzame transversale relaxatie)12. Vanuit een standaardperspectief zijn de NMR-signalen van het glycaan smal, terwijl die van de receptor breed zijn13.
Op ligand gebaseerde NMR-methoden zijn gebaseerd op de dramatische verandering die veel glycaan NMR-parameters ervaren bij het overgaan van de vrije naar de gebonden toestand14. STD-NMR is de meest gebruikte experimentele NMR-techniek om diverse glycaanbindingskenmerken15 te beoordelen, van het afleiden van het bestaan van binding in de oplossingstoestand tot de bepaling van het glycaanbindende epitoop; Dat wil zeggen, de atomen van het ligand die in contact staan met de eiwitreceptor16.
Als alternatief monitoren op receptoren gebaseerde NMR-methoden de veranderingen die plaatsvinden in de signalen van de eiwitreceptor in aanwezigheid van het glycaan ten opzichte van die geregistreerd voor de apo-toestand17. Deze zijn voornamelijk gericht op het screenen van de chemische verschuivingsverstoringen van de eiwitsignalen tussen beide toestanden. Het meest gebruikte experiment is 1 H-15N HSQC, of de TROSY-alternatieven18.
De combinatie van beide benaderingen maakt het mogelijk om NMR toe te passen op veel uiteenlopende systemen die een breed scala aan affiniteiten vertonen. Voor de receptorgebaseerde NMR-methoden moet echter, in tegenstelling tot die op basis van het ligand, een relatief grote hoeveelheid oplosbaar, niet-geaggregeerd, stabiel isotoop-gelabeld (15N) eiwit beschikbaar zijn.
Hierin beschrijven we beide methoden, waarbij we hun sterke en zwakke punten benadrukken. Merk op dat de basisstappen die in het protocol worden beschreven, als voorbeeld dienen voor het gebruik van Bruker-spectrometers. Bijgevolg komen de namen van commando’s en parameters overeen met die welke worden gebruikt in TopSpin (de besturingssoftware voor spectrometers van Bruker).
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschil in verzadigingsoverdracht NMR (STD-NMR) is de meest gebruikte en veelzijdige NMR-methode geworden voor het bestuderen van ligand-eiwitinteracties. Zoals hierboven aangetoond, is het gebaseerd op het fenomeen van de verzadigingsoverdracht, en de experimentele opzet omvat de verwerving van twee eendimensionale (1D) 1H-spectra: de on-resonantie- en de “off-resonantie”-spectra. Tijdens het resonantie-experiment wordt verzadiging van specifieke protonen van het eiwit bereikt door gedurende een bepaalde periode een reeks radiofrequente pulsen met een laag vermogen toe te passen (de verzadigingstijd varieert doorgaans van 1-3 s). Om directe verzadiging van het ligand te voorkomen, worden de frequentie en lengte van de verzadigingspulsen geoptimaliseerd voor het selectief bestralen van specifieke protonen van het eiwit; d.w.z. ze moeten worden aangebracht op een frequentie die vrij is van ligandsignalen en met een passende lengte (Figuur 1). Als vuistregel geldt dat voor verzadigingspulsen van 50 ms een verschil van 1 ppm moet worden aangehouden tussen het verzadigingsgebied en de dichtstbijzijnde ligandsignalen. Over het algemeen zorgen selectieve verzadigingspulsen die op het alifatische gebied van het eiwit worden aangebracht voor verhoogde verzadigingseffecten. Als alternatief kunnen aromatische protonen (6-7 ppm) ook worden bestraald als het ligandmolecuul geen aromatische signalen bevat. Dit is erg handig voor natuurlijk voorkomende glycanen, omdat ze geen aromatische groepen dragen. Zodra een bepaald gebied van het eiwit selectief wordt bestraald, plant de verzadiging zich langs het eiwit voort via dipolaire 1 H-1H kruisontspanning (spindiffusie). Uiteindelijk bereikt de verzadiging de eiwitprotonen op de bindingsplaats, die vervolgens wordt overgebracht naar de suikerprotonen die in nauw contact staan (r < 5 Å) met de receptor via intermoleculaire 1 H-1H NOE’s. Het is duidelijk dat de intensiteit van de signalen van de verzadigde ligandprotonen afneemt. Na ontvangst van de verzadiging dissociëren de tijdelijk gebonden liganden (snelle uitwisseling is vereist) als gevolg van de bindingskinetiek en wordt de verzadigingsinformatie geaccumuleerd in de vrije toestand. Als gevolg van dit proces vertonen de NMR-on-resonantiespectra verminderde signalen (Figuur 2).
Om deze intensiteitsverstoring van de 1H-kernen van een bindend glycaan duidelijk aan te tonen, wordt een NMR-spectrum van controleprotonen (off-resonantie) verkregen waarin de verzadiging ver weg van een receptor of koolhydraatsignaal wordt toegepast (meestal tussen 40-100 ppm), onder dezelfde omstandigheden. Het afgetrokken 1D-spectrum tussen de off-resonantie en de on-resonantie toont uitsluitend de signalen van de 1H-kernen van de ligand die gewijzigde intensiteiten hebben: die welke dicht genoeg bij de receptorbindingsplaats waren om de magnetisatie te ontvangen (Figuur 2).
Desalniettemin krijgen niet alle 1H-kernen van het gebonden koolhydraat dezelfde hoeveelheid verzadiging. Theoretisch is de magnetisatieoverdracht van de receptor naar het gebonden ligand afstandsafhankelijk (1/r6). Dit betekent dat de intensiteiten van de overgedragen verzadiging tussen de glycaan 1H-kernen informatie bevatten over de ruimtelijke nabijheid tussen de protonen van de ligand en die van de receptor, en dat de SOA NMR-intensiteiten groter zijn voor die protonen die zich dichter bij de receptor bevinden. Dienovereenkomstig maakt het STD NMR-experiment het ook mogelijk om het bindingsepitoop van het koolhydraat te bepalen (Figuur 2 en Figuur 3), aangezien protonen van het ligand die dichter bij het eiwitoppervlak zitten, hogere intensiteiten vertonen dan protonen die niet direct deelnemen aan de binding.
Het experiment kan worden toegepast op systemen met een zwak-gemiddelde affiniteit, zelden op systemen met sterke affiniteiten in het lage μM- of nM-bereik. Het vereist inderdaad dat de dissociatiesnelheid snel is in de ontspanningstijdschaal. Anders gaat de informatie over de verzadigingsoverdracht verloren door ontspanning voordat het ligand dissocieert.
Aan de andere kant zijn op eiwitten gebaseerde NMR-experimenten uniek voor het ontrafelen van ligand-eiwitinteractie met nauwkeurigheid op aminozuurniveau zonder de atomaire resolutiestructuren op te lossen. Het onderzoekt direct moleculaire herkenningsverschijnselen in oplossing zonder de noodzaak van co-kristallisatie. Het in kaart brengen van CSP-analyse is uitzonderlijk krachtig voor het ontdekken van liganden en het in kaart brengen van de eiwitbindingsplaats (Figuur 4 en Figuur 5). Deze methode is van toepassing op elk bereik van affiniteiten tussen het mM- en nM-bereik, zelfs voor systemen waar de wisselkoers traag is in de chemische verschuivingstijdschaal21.
Toch zal deze aanpak waarschijnlijk niet werken voor eiwitten met een molecuulgewicht boven 30-40 kDa vanwege relaxatieproblemen. Het TROSY-alternatief18 kan dan worden gebruikt, dat bijzonder krachtig is in combinatie met eiwitdeuteratie. Bovendien moet het eiwit uniform worden gelabeld met 15N (en een ander monster dubbel gelabeld met 13C en 15N om de vereiste ruggengraattoewijzing te kunnen voltooien). Daarom moeten de condities voor eiwitexpressie, inclusief het bijbehorende expressiesysteem, worden geoptimaliseerd om milligrammen eiwit te kunnen verkrijgen. Eiwitten die de neiging hebben om te oligomeriseren of te aggregeren, zijn ook niet geschikt voor deze analyse. Het instrument dat hierin wordt gebruikt om de NMR-gegevens vast te leggen, is een Bruker 800 MHz-spectrometer die is uitgerust met een TCI-cryoprobe. Het zou een grote uitdaging zijn om deze methodologie te gebruiken met behulp van instrumenten onder de 600 MHz of zonder een cryogene sonde.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Agencia Estatal de Investigación uit Spanje voor de Severo Ochoa Center of Excellence Accreditation CEX2021-001136-S, gefinancierd door MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, en CIBERES, een initiatief van Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madrid, Spanje). We danken ook de Europese Commissie voor het GLYCOTWINNING-project.
Materials
| 5 mm Shigemi microtube set mat | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
| Alpha-Lactose-Agarose | Sigma-Aldrich Química S.L. | 7634-5ML | |
| Ammonium chloride (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologías Analíticas S.L | |
| Ampicillin (Sodium Salt) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
| BIOVIA Discovery studio | BIOVIA, Dassault Systèmes | ||
| BL21(DE3) Chemically Competent Cells | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-22R | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
| Incubator | Eppendorf | Innova 42 | |
| IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
| LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
| Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
| PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
| PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrödinger | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | VC 505 | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
References
- Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
- Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution. Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).
- Kogelberg, H., Solís, D., Jiménez-Barbero, J. New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).
- Widmalm, G. Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy. JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).
- Marchetti, R., et al. 34;Rules of Engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).
- Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy. Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).
- Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).
- Cañada, F. J., et al. Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR. Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).
- Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans. ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).
- Jiménez-Barbero, J., Asensio, J. L., Cañada, F. J., Poveda, A. Free and protein-bound carbohydrate structures. Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).
- Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
- Roldós, V., Cañada, F. J., Jiménez-Barbero, J. Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR. Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).
- Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J., Millet, O. NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions. Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).
- del Carmen Fernández-Alonso, M., Díaz, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Cañada, J., Jiménez-Barbero, J. Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).
- Angulo, J., Nieto, P. M. STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach. Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).
- Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
- Williamson, M. P. Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).
- Fernández, C., Adeishvili, K., Wüthrich, K. Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).
- Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. Solution NMR in structural genomics. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).
- Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis. J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).
- Gimeno, A., et al. Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).
.