Kwantificering van de dendritische wervelkolom met behulp van automatische driedimensionale neuronreconstructiesoftware

Dendritische stekels zijn uitsteeksels van dendrieten die vaak de postsynaptische plaats van glutamaterge synapsen omvatten ^1,2. Dendritische stekels zijn van bijzonder belang op het gebied van synaptische plasticiteit. Stekels worden vaak veranderd wanneer de synaptische kracht verandert, en worden groter en sterker bij synaptische potentiëring op de lange termijn of kleiner en zwakker bij langdurige synaptische depressie 3,4,5,6,7. Naast synaptische plasticiteit verandert het profiel van dendritische stekels gedurende de levensduur. In de vroege ontwikkeling is er een periode van vorming en groei van de dendritische wervelkolom, gevolgd door het snoeien van de dendritische wervelkolom tot het bereiken van een stabiele toestand ^8,9,10. In de ouder wordende hersenen gaat het verlies van de wervelkolom gepaard met krimp van de hersenen en cognitieve achteruitgang¹¹. Bovendien worden veel neurologische, neurodegeneratieve en psychiatrische aandoeningen gekenmerkt door afwijkende dendritische stekels. Meerdere hersengebieden bij personen met schizofrenie hebben minder dendritische stekels, waarschijnlijk als gevolg van veranderde synaptische snoei¹². Autismespectrumstoornissen worden ook gekenmerkt door pathologieën van de dendritische wervelkolom¹³. Verlies van dendritische wervelkolom is een kenmerk van zowel de ziekte van Alzheimer als de ziekte van Parkinson ^14,15. Gezien het brede scala aan onderzoeksonderwerpen die onderzoek naar de eigenschappen van dendritische wervelkolom omvatten, zijn technieken voor nauwkeurige kwantificering van de wervelkolom van het grootste belang.

Kleuring, d.w.z. de Golgi-methode, of het labelen van neuronen via kleurstofvulling of het tot expressie brengen van fluorescerende eiwitten zijn veelgebruikte methoden voor visualisatie van de dendritische wervelkolom 16,17,18. Eenmaal gevisualiseerd, kunnen stekels worden geanalyseerd met een verscheidenheid aan gratis en in de handel verkrijgbare softwareclients. De gewenste output van de analyse is een belangrijke factor om te bepalen welke software het meest bruikbaar zal zijn. Fiji is een haalbare software-optie voor vragen over de dichtheid van de dendritische wervelkolom. Deze techniek is echter grotendeels afhankelijk van tijdrovende handmatige tellingen die de kans op vertekening kunnen introduceren. Nieuwe plug-ins zoals SpineJ maken automatische kwantificering mogelijk, waardoor bovendien een nauwkeurigere analyse van de wervelkolom mogelijk is¹⁹. Een nadeel van deze benaderingen is het verlies van een driedimensionale analyse voor het bepalen van het wervelkolomvolume, aangezien SpineJ beperkt is tot tweedimensionale beeldstapels. Bovendien wordt het verkrijgen van informatie over het subtype van de wervelkolom via deze processen een uitdaging. De vier overheersende subtypes van de wervelkolom, dun, paddestoel, stomp en filopodia, duiden allemaal op individuele functies en worden grotendeels geclassificeerd via morfologie²⁰. Dunne stekels worden gekenmerkt door een langwerpige nek en een gedefinieerd hoofd²¹. Paddenstoelstekels hebben een veel grotere en geprononceerde stekel²². Stompe stekels zijn kort en hebben weinig variatie tussen hoofd en nek²³. Filopodia zijn onrijpe stekels met een lange, dunne nek en geen duidelijk waarneembare kop²⁴. Hoewel classificatie waardevolle informatie oplevert, bestaan stekels op een continuüm van dimensies. De indeling in categorieën is gebaseerd op morfologische metingen^25,26. Het handmatig meten van stekels voor classificatie vergroot de logistieke last voor onderzoekers in deze aanpak.

Andere software-opties die specifiek gericht zijn op driedimensionale analyse van de dendritische wervelkolom zijn beter geschikt voor onderzoek naar het volume en de eigenschappen van het subtype van de wervelkolom 27,28,29,30,31. Ondanks de moeilijkheid van driedimensionale analyse, zoals een slechte resolutie van het z-vlak en uitstrijkjes, maken deze software-opties een betrouwbare driedimensionale reconstructie van dendrieten en dendritische stekels mogelijk op een door de gebruiker geleide semi-geautomatiseerde manier. Automatische classificatie van geïdentificeerde stekels in hun subtypen is ook een functie die aanwezig is in sommige van deze softwarepakketten voor wervelkolomanalyse. Dit kan de bezorgdheid over mogelijke werkdruk en experimentele vooringenomenheid wegnemen. Neurolucida 360 is een in de handel verkrijgbare software die betrouwbare en reproduceerbare driedimensionale identificatie en classificatie van de dendritische wervelkolom mogelijk^{maakt 32}. Hier presenteren we een uitgebreid protocol om vast weefsel effectief voor te bereiden, beelden te verkrijgen en uiteindelijk dendritische stekels te kwantificeren en te classificeren met behulp van deze software.