Summary

通过冷冻切片初步验证立体定向注射坐标

Published: July 19, 2024
doi:

Summary

本方案描述了一种实用策略,用于在使用染料和冷冻切片进行病毒示踪之前加快立体定位注射坐标的验证步骤。

Abstract

特定大脑区域的立体定向注射构成了基础神经科学中的一项基本实验技术。研究人员通常根据小鼠脑图谱或已发表的材料来选择立体定位注射参数,这些材料采用了不同群体/年龄的小鼠和不同的立体定位设备,因此需要进一步验证立体定位坐标参数。钙成像、化学遗传学和光遗传学操作的功效依赖于感兴趣区域内报告基因的精确表达,通常需要数周的努力。因此,如果不事先验证目标大脑区域的坐标,这将是一项耗时的任务。使用适当的染料代替病毒并实施冷冻切片,研究人员可以在染料给药后立即观察注射部位。这有助于在实际注射位置和理论位置之间存在差异的情况下及时调整坐标参数。在随后的实验中,这种调整显著提高了靶区域内病毒表达的准确性。

Introduction

几乎所有现代神经调控工具,包括体内钙记录、光遗传学和化学遗传学工具,都需要使用立体定位坐标来靶向感兴趣的大脑区域 1,2,3,从而形成神经操作的基础。小鼠大脑区域的立体定位坐标是相对于前囟和λ(颅骨上的骨标志)定义的,形成了所谓的颅骨衍生的立体定位坐标系统。bregma 或 lambda 都可以用作三维坐标的零点。这三个轴是前后轴 (AP)、内外侧轴 (ML) 和背腹轴 (DV),代表立体定位仪器数字显示屏上的 y、x 和 z 轴。对于众所周知的大脑区域,特定区域的立体定位坐标参数可以从小鼠脑图谱4(例如,Paxinos和Franklin的小鼠大脑在立体定位坐标中)和/或已发表的文献5,6中获得。然而,由于立体定位设备的变化和不同研究人员使用的小鼠的年龄/群体,需要进一步验证。

结构是功能的基础。神经回路构成了许多大脑功能的基础,例如认知活动、情绪、记忆、感觉和运动功能1.标记结构和操纵神经回路的活动对于理解特定神经回路的功能至关重要。在过去的几十年里,神经示踪剂已经进化了好几代;早期研究采用小麦胚芽凝集素(WGA)和菜豆凝集素(PHA)作为顺行示踪剂,氟金(FG)、霍乱毒素B亚基(CTB)、痰花青作为逆行示踪剂。然而,与病毒示踪剂不同,这些传统的神经示踪剂不能将外源基因整合到宿主中,也不具有细胞类型选择性。如今,病毒策略已成为基础神经科学研究中的一个重要命题。针对不同的研究目的,可以选择各种病毒工具7,8。有非跨突触病毒、反式多突触病毒(逆行和顺行)和跨单突触病毒(逆行和顺行)。每个类别都包含几种具有各自特征的类型。

病毒给药和表达的过程非常耗费时间和资源,通常需要数周甚至更长时间。在各种病毒载体中,腺相关病毒已被确定为一种有前途的基因递送手段,为实验程序提供了注射后 3 至 8 周的广泛窗口 7,8。随着 AAV 的发展,可以在给药后 2-3 周进行分析 9,10。其他神经回路示踪剂,如伪狂犬病病毒 (PRV) 和狂犬病病毒 (RV),也需要至少 2-7 天的追踪期 11,12,13,14,15。因此,在观察荧光信号之前对注射部位进行初步验证既省时又经济。

为了便于简单快速地验证立体定向注射,在这项研究中,在病毒载体之前施用染料,冷冻切片使研究人员能够在注射后 30 分钟内观察注射部位并对其进行追踪。

Protocol

所有动物实验均按照《动物研究报告体内实验》(ARRIVE)指南和美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。本研究经上海交通大学医学院附属仁济医院动物护理与使用专业委员会批准。本研究采用8周龄C57BL/6J雄性小鼠。这些动物是商业获得的(见 材料表)并饲养在标准笼子中(22°C±2°C,12小时/ 12小时光照/黑暗循环,食物和水随意)。 1. 目标?…

Representative Results

该研究使用演示的方法在 30 分钟内成功确定了注射部位。最初,将含有溴酚蓝的SDS-PAGE样品上样溶液注射到C57 / BL小鼠的LDTgV中。 图1A 显示了染料溶液注入的示意图。蓝色染料在LDTgV中的分布如图 1B所示。 还将溴酚蓝注射到 mPFC 前边缘皮层、mPFC 边缘下皮层和基底杏仁核 (BMA) 中,以评估该方案的普遍性。如图1C-E</…

Discussion

本文描述了一种稳定的策略,可以在病毒追踪之前更快、更简单地验证立体定向脑注射的准确性 5,6报告基因在大脑区域表达的不可替代性对于大脑区域标记至关重要。我们使用的蓝色染料可以立即看到注射部位。

该协议中的几个关键步骤有助于提高注射部位的准确性。首先,从步骤1.5开始,确保大脑在立体定位仪中的左右水?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

国家自然科学基金(授予孙晓彦82101249项),国家博士后科研工作基金(授予孙晓彦,批准号:2022M722125授予孙晓彦)。上海市帆船项目(授权号:21YF1425100)上海市卫生健康委员会临床研究专项(J 周 202340088 号拨款).国家自然科学基金(第82101262项授予张旭,第82101287项授予陈旭)。

Materials

1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 Hamilton 65458-01
200 μL pipette tips biosharp BS-200-T
20 mL syringe Kindly group
3%H2O2 solution Lircon Company
6-well plate Shengyou Biotech 20006
Anerdian Likang High-tech 31001002
Anti roll plate Leica 14047742497
BD insulin syringe Becton,Dickinson and Company 328421
Bend toothed dissecting forceps Jinzhong JD1050
Cellsens dimension software Olympus
Cotton swab Fisher Scientific 23-400-122
Dapi-Fluoromount-G Southernbiotech 0100-20
Drill Longxiang
Fine brushes HWAHONG
Fine scissors Jinzhong y00030
Fluorescent microscopy Olympus BX63
freezing microtome Leica CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth Jinzhong J31010
Infusion needle 0.7 mm Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection Harvest Pharmaceutical Company 71230803
Magnifying glass M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold RWD Life Science 68713
Microcentrifuge tube biosharp BS-02-P
Microtome blades Leica 819
Ophthalmic ointment Cisen Pharmaceutical Company G23HDM9M4S5
paraformaldehyde Biosharp BL539A
Peristaltic pumps Harvard Apparatus 70-4507
Phosphate buffered saline Servicebio G4202
Piette 2-200 μL thermofisher 4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue Beyotime P0015A
Shaving blades BFYING 91560618
Slides Citotest Scientific 188105
Stereotaxic apparatus RWD Life Science 68807
Straight toothed dissecting forceps Jinzhong JD1060
Syringe Holder RWD Life Science 68206
Tissue scissors Jinzhong J21040
Tissue-Tek O.C.T compound Sakura 4583
Tribromoethanol Aibei Biotechnology M2910

References

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Cite This Article
Zhou, X., Dai, W., Zhou, J., Zhang, Y., Zhang, X., Chen, S., Sun, X. Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning. J. Vis. Exp. (209), e66262, doi:10.3791/66262 (2024).

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