Summary

Генерация и последующий анализ одноклеточных и одноядерных транскриптомов в органоидах мозга

Published: March 29, 2024
doi:

Summary

В этой статье мы представляем комплексный протокол для генерации и последующего анализа органоидов человеческого мозга с использованием секвенирования одиночных клеток и одноядерных РНК.

Abstract

За последнее десятилетие транскриптомика одиночных клеток значительно эволюционировала и стала стандартным лабораторным методом для одновременного анализа профилей экспрессии генов отдельных клеток, позволяющим улавливать клеточное разнообразие. Для преодоления ограничений, связанных с трудно изолируемыми типами клеток, для секвенирования может быть использован альтернативный подход, направленный на восстановление отдельных ядер вместо интактных клеток, что делает транскриптомное профилирование отдельных клеток универсально применимым. Эти методы стали краеугольным камнем в изучении органоидов мозга, установив их в качестве моделей развивающегося человеческого мозга. Используя потенциал одноклеточной и одноядерной транскриптомики в исследованиях органоидов мозга, этот протокол представляет собой пошаговое руководство, охватывающее ключевые процедуры, такие как диссоциация органоидов, выделение одиночных клеток или ядер, подготовка библиотеки и секвенирование. Реализуя эти альтернативные подходы, исследователи могут получить высококачественные наборы данных, позволяющие идентифицировать типы нейронных и ненейрональных клеток, профили экспрессии генов и траектории клеточной линии. Это способствует всестороннему исследованию клеточных процессов и молекулярных механизмов, формирующих развитие мозга.

Introduction

В последние годы органоидные технологии стали перспективным инструментом для культивирования органоподобных тканей 1,2,3. Особенно для органов, которые не могут быть легко доступны, таких как человеческий мозг, органоиды дают возможность получить представление о развитиии проявлении болезней. Таким образом, органоиды мозга широко используются в качестве экспериментальной модели для исследования различных расстройств мозга человека, включая заболевания развития, психиатрические или даже нейродегенеративныезаболевания.

С появлением технологий профилирования транскриптома одиночных клеток, первичные ткани человека и сложные модели in vitro стали изучаться с беспрецедентным уровнем детализации, что позволяет получить механистическое представление об изменениях экспрессии генов на уровне клеточных субпопуляций в норме и при заболеваниях и получить информацию о новых предполагаемых терапевтических мишенях 7,8,9. Развитие органоидной области было достигнуто за счет использования профилирования транскриптома одиночных клеток для оценки клеточного состава, воспроизводимости и точности технологий органоидов мозга 10,11,12. Секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) позволило классифицировать клетки и выявить генетическую дисрегуляцию в больных органоидах13,14. Важно отметить, что именно сложность органоидных тканей обуславливает необходимость внедрения методов, позволяющих профилировать отдельные клетки. Характеристика органоидов с помощью таких методов, как объемное профилирование транскриптома (объемное секвенирование РНК), приводит к маскировке клеточной гетерогенности и профилям экспрессии генов, которые усредняются по всем типам клеток в сложной ткани, что в конечном итоге ограничивает наше понимание текущих процессов во время развития органоидов в здоровом и больномсостоянии 15,16,17. По мере того, как методы scRNA-seq продолжают развиваться, создается все большее число атласов, примером которых являются такие ресурсы, как Атлас мозга Аллена или Атлас органоидов человеческого мозга с одиночными клетками Uzquiano et al.18.

Успешное получение scRNA-seq из органоидов мозга зависит от эффективной изоляции и захвата интактных клеток. Поскольку диссоциация органоидов мозга с получением отдельных клеток основана на ферментативном пищеварении, она может влиять на паттерны экспрессии генов, вызывая стресси повреждение клеток. Следовательно, диссоциация ткани на отдельные клетки является наиболее важным шагом. Альтернативным подходом является одноядерное секвенирование РНК (snRNA-seq), которое способствует экстракции ядер без ферментов как из свежей, так и из замороженной ткани21,22. Однако выделение ядер из ткани сопряжено с другими проблемами, такими как обогащение представляющих интерес типов клеток и низкое содержание РНК в ядрах по сравнению с клетками.

Транскриптомные исследования органоидов головного мозга обычно проводятся с использованием scRNA-seq 10,18,23. Тем не менее, выделение одиночных ядер может обеспечить ортогональный и дополнительный метод для исследования транскриптомного профиля органоидов. В этой статье мы представляем набор инструментов для scRNA- и snRNA-seq для органоидов мозга и обсуждаем критические моменты для получения данных секвенирования наилучшего качества.

Protocol

Описанный протокол выполнен в лаборатории уровня биобезопасности 1 Центра молекулярной медицины им. Макса Дельбрюка (номер одобрения: 138/08), в соответствии с требованиями и в соответствии с правилами ЕС и национальными правилами этики в исследованиях. 1. Получение орга…

Representative Results

Для исследования клеточного состава органоидов головного мозга с использованием scRNA-seq и snRNA-seq органоиды мозга были собраны после 30 дней культивирования, поскольку органоиды на этой стадии уже демонстрируют нейроэпителиальные петли, состоящие из предшественников, окруженных промежут…

Discussion

Транскриптомный анализ отдельных клеток и отдельных ядер стал ключевым инструментом для понимания механизмов регуляции генов в сложных тканях. Оба метода позволяют проводить транскриптомные исследования органоидов мозга. Для обеспечения общего успеха эксперимента большое значение…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Благодарим Валерию Фернандес-Валлоне за оригинальную инструкцию к набору Miltenyi Neural Dissociation. Мы также благодарим технологическую платформу геномики Центра Макса Дельбрюка за предоставленный рецепт буфера для лизиса NP40 и ценные советы по настройке этого протокола. Мы также благодарим Маргарету Херцог и Александру Чернычев за организационную поддержку лаборатории.

Materials

1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) Sigma  43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes  VWR 525-0130 microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline  analysis pipline
15 ml Falcon Falcon Centrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME) Life Technologies 21985023
50 ml Falcon Falcon Centrifuge tube
A83-01 Bio Technologies 379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) Life Technologies 15240062
B-27 Plus Supplement Life Technologies 17504044
B-27 Supplement without vitamin A Life Technologies 12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) Sigma Aldrich A8806-5G 
cAMP Biogems 6099240
cAMP Biogems 6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED VWR DHC-N01
Cell strainer 40 µm Neolab 352340
Cell strainer 70 µm (white) Nylon Sigma CLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit 10X Genomics 1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns 10X Genomics 1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 10X Genomics 1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill Roche 11873580001
DAPI MERCK Chemicals 0000001722
DMEM/F12 Life Technologies 11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL complete Sigma Aldrich 10536355
Essential E8 Flex Medium Life Technologies A2858501
EVE Cell Counting Slides VWR EVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) PAN Biotech P30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating) Life Technologies A1413302 
gentleMACS Miltenyi Biotec dissociation maschine
GlutaMAX supplements Life Technologies 35050038
Heparin sodium cell culture tested Sigma H3149-10KU
human recombinant BDNF StemCell Technologies 78005.3
human recombinant GDNF StemCell Technologies 78058.3
Insulin Solution Human Sigma Aldrich I2643-25MG
Knockout serum replacement Life Technologies 10828028
LDN193189 Hydrochloride 98% Sigma Aldrich 130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x) Sigma Aldrich M7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free Thermo Scientific AM9530G
mTeSR Plus StemCell Technologies 100-0276 stem cell medium
mTeSR1 StemCell Technologies 85850 stem cell medium
N2 Supplement  StemCell Technologies 17502048
Neural Tissue Dissociation Kit Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG 130-092-628
Neurobasal Plus Life Technologies A3582901
NextSeq500 system Illumina Sequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution Life Technologies 28324
PBS Dulbecco’s Invitrogen 14190169
PenStrep (Penicillin – Streptomycin) Life Technologies 15140122
Percoll Th. Geyer 10668276
Pluronic (R) F-127 Sigma Aldrich P2443-1KG
RiboLock RNase Inhibitor Life Technologies  EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB Biomol Cay10005583-10
SB 431542  Biogems 3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL Invitrogen AM9760G
StemFlex Medium Thermo Scientific A3349401 stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyi Biotec 130-104-368 stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottom Sarstedt 83.3925.500
TISSUi006-A TissUse GmbH https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan Blue T8154-20ml Sigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol red Life Technologies 12604013 Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 Life Technologies 15567027
XAV939 Enzo Life sciences BML-WN100-0005

References

  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715 (2015).
  3. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954 (2017).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  6. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929 (2021).
  7. Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169 (2021).
  8. Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
  9. Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
  10. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  11. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312 (2022).
  12. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  13. Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
  14. Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
  15. Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
  16. Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
  17. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
  18. Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
  19. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944 (2020).
  20. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  21. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694 (2021).
  23. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
  24. Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213 (2023).
  25. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
  26. Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350 (2021).
  27. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  28. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  29. Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339 (2022).
  30. Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44 (2017).

Play Video

Cite This Article
Wandres, M., Aigner, D., Kastelic, N., Boltengagen, A., Rybak-Wolf, A., Rajewsky, N. Generation and Downstream Analysis of Single-Cell and Single-Nuclei Transcriptomes in Brain Organoids. J. Vis. Exp. (205), e66225, doi:10.3791/66225 (2024).

View Video