Kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) har utvecklats till en allmänt använd metod för att visualisera biologiska makromolekyler¹. Med hjälp av framsteg inom direkt elektrondetektion ^2,3,4, datainsamling⁵ och bildbehandlingsalgoritmer ^6,7,8,9,10 kan cryoEM nu producera 3D-strukturer med nära atomär upplösning av ett snabbt växande antal makromolekyler¹¹. Dessutom, genom att utnyttja metodens enmolekylkaraktär, kan användare bestämma flera strukturer från ett enda prov 12,13,14,15, vilket belyser löftet om att använda de data som genereras för att förstå heterogena strukturella ensembler^16,17. Trots dessa framsteg kvarstår flaskhalsar i beredningen av kryoprover.

För strukturell karakterisering med kryoEM bör biologiska prover vara väl dispergerade i vattenlösning och sedan snabbfrysas genom en process som kallas vitrifikation ^18,19. Målet är att fånga partiklar i ett jämnt tunt lager av förglasad is som är upphängd i regelbundet åtskilda hål som vanligtvis skärs i ett lager av amorft kol. Denna mönstrade amorfa kolfolie stöds av ett TEM-galler med ett nät av koppar- eller guldstödstänger. I standardarbetsflöden görs rutnät hydrofila med hjälp av en plasmabehandling med glödurladdning före applicering av provet. Överskottsvätska torkas med filterpapper, vilket gör att proteinlösningen kan bilda en tunn flytande film över hålen som lätt kan förglasas under djupfrysning. Vanliga utmaningar inkluderar partikellokalisering till luft-vattengränssnittet (AWI) och efterföljande denaturering^20,21,22 eller antagande av föredragna orienteringar 23,24,25, partikelvidhäftning till kolfolien snarare än att migrera in i hålen, och kluster och aggregering av partiklarna i hålen²⁶. Ojämn istjocklek är ett annat problem; Tjock is kan resultera i högre nivåer av bakgrundsbrus i mikrograferna på grund av ökad elektronspridning, medan extremt tunn is kan utesluta större partiklar²⁷.

För att ta itu med dessa utmaningar har en mängd olika tunna stödfilmer använts för att belägga gallerytor, vilket gör att partiklar kan vila på dessa stöd och helst undvika interaktioner med luft-vattengränssnittet. Grafenstöd har visat sig mycket lovande, delvis på grund av deras höga mekaniska hållfasthet i kombination med deras minimala spridningstvärsnitt, vilket minskar bakgrundssignalen som tillförs av stödskiktet²⁸. Förutom sitt minimala bidrag till bakgrundsbrus uppvisar grafen också en anmärkningsvärd elektrisk och termisk ledningsförmåga²⁹. Grafen och grafenoxidbelagda rutnät har visat sig ge högre partikeldensitet, mer enhetlig partikelfördelning³⁰ och minskad lokalisering till AWI²². Dessutom ger grafen en stödyta som kan modifieras ytterligare för att: 1) finjustera rutnätsytans fysiokemiska egenskaper genom funktionalisering 31,32,33; eller 2) kopplingsmedel som underlättar affinitetsrening av proteiner av intresse 34,35,36.

I den här artikeln har vi modifierat en befintlig procedur för att belägga cryoEM-rutnät med ett enda enhetligt lager av grafen³⁰. Ändringarna syftar till att minimera näthanteringen genom hela protokollet, med målet att öka avkastningen och reproducerbarheten. Dessutom diskuterar vi vårt tillvägagångssätt för att utvärdera effektiviteten av olika UV/ozonbehandlingar för att göra rutnät hydrofila före nedsänkning. Detta steg i kryoEM-provberedning med grafenbelagda rutnät är kritiskt, och vi har funnit att vår enkla metod för att kvantifiera den relativa hydrofiliciteten hos de resulterande rutnäten är användbar. Med hjälp av detta protokoll demonstrerar vi nyttan av att använda grafenbelagda rutnät för strukturbestämning genom att generera en högupplöst 3D-rekonstruktion av katalytiskt inaktiva S. pyogenes Cas9 i komplex med guide-RNA och mål-DNA.