التهجين سلسلة تفاعل الحمض النووي الريبي كامل جبل مضان في الموقع تهجين الجينات الحسية الكيميائية في الزوائد الشمية البعوض
Summary
تصف المقالة الطرق والكواشف اللازمة لأداء تفاعل سلسلة التهجين RNA مضان كامل التركيب في الموقع (HCR RNA WM-FISH) للكشف عن رؤى حول الدقة المكانية والخلوية لجينات المستقبلات الحسية الكيميائية في هوائي البعوض والجس الفكي.
Abstract
البعوض هو ناقل فعال للأمراض الفتاكة ويمكنه التنقل في بيئته الكيميائية باستخدام المستقبلات الحسية الكيميائية المعبر عنها في الزوائد الشمية. إن فهم كيفية تنظيم المستقبلات الحسية الكيميائية مكانيا في الزوائد الشمية الطرفية يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة حول كيفية تشفير الرائحة في نظام حاسة الشم للبعوض وإبلاغ طرق جديدة لمكافحة انتشار الأمراض التي ينقلها البعوض. يسمح ظهور الجيل الثالث من تفاعل سلسلة التهجين RNA الكامل في التهجين في التهجين الموقع (HCR RNA WM-FISH) برسم الخرائط المكانية والتنميط المتزامن للتعبير عن جينات حسية كيميائية متعددة. هنا ، نصف نهجا متدرجا لأداء HCR RNA WM-FISH على هوائي البعوض Anopheles وجس الفك العلوي. قمنا بالتحقيق في حساسية هذه التقنية من خلال فحص ملف تعريف التعبير للمستقبلات الشمية الأيونية. سألنا عما إذا كانت تقنية HCR WM-FISH الموصوفة مناسبة للدراسات المتعددة عن طريق ربط مجسات الحمض النووي الريبي بثلاثة فلوروفورات متميزة طيفيا. قدمت النتائج دليلا على أن HCR RNA WM-FISH حساس بشدة للكشف في وقت واحد عن جينات حسية كيميائية متعددة في الهوائي والزوائد الشمية الجسية الفكية. وتشهد المزيد من التحريات على ملاءمة HCR WM-FISH لتحديد سمات التعبير المشترك لأهداف الحمض النووي الريبي المزدوج والثلاثي. هذه التقنية ، عند تطبيقها مع التعديلات ، يمكن أن تكون قابلة للتكيف لتوطين الجينات ذات الأهمية في الأنسجة الشمية لأنواع الحشرات الأخرى أو في الزوائد الأخرى.
Introduction
تعتمد ناقلات البعوض مثل Anopheles gambiae على ذخيرة غنية من الجينات الحسية الكيميائية المعبر عنها في الزوائد الشمية المحيطية لتزدهر في عالم كيميائي معقد وتحديد الروائح ذات الصلة سلوكيا المنبعثة من المضيفين البشريين ، واكتشاف مصادر الرحيق ، وتحديد مواقع وضع البيض1. يتم إثراء هوائي البعوض وجس الفك العلوي بالجينات الحسية الكيميائية التي تدفع اكتشاف الرائحة في هذه الزوائد الشمية. ثلاث فئات رئيسية من القنوات الأيونية ذات البوابات تدفع الكشف عن الرائحة في الزوائد الشمية للبعوض: مستقبلات الرائحة (ORs) ، التي تعمل مع مستقبلات مستقبلات مشتعلة ملزمة للرائحة (Orco) ؛ المستقبلات الأيونية (IRs) ، التي تتفاعل مع واحد أو أكثر من مستقبلات الأشعة تحت الحمراء (IR8a و IR25a و IR76b) ؛ المستقبلات الحسية الكيميائية الذوقية (GRs) ، والتي تعمل كمركب من ثلاثة بروتينات للكشف عن ثاني أكسيد الكربون (CO2) 1,2.
يعد مضان الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين أداة قوية للكشف عن التعبير عن mRNA3 الداخلي. بشكل عام ، تستخدم هذه الطريقة مسبار حمض نووي مفرد تقطعت به السبل يحمل علامة الفلوروفور مع تسلسل مكمل ل mRNA المستهدف. يسمح ربط مسبار الحمض النووي الريبي الفلوري بالحمض النووي الريبي المستهدف بتحديد الخلايا التي تعبر عن نسخة من الاهتمام. تتيح التطورات الحديثة الآن اكتشاف النصوص في أنسجة البعوض الكاملة 4,5. استخدم الجيل الأول من تقنية تفاعل سلسلة التهجين (HCR) مضخم HCR قائم على الحمض النووي الريبي. تم تحسين هذا في طريقة الجيل الثاني التي استخدمت بدلا من ذلك الحمض النووي الهندسي لمكبر الصوتHCR 6,7. أدت هذه الترقية إلى زيادة 10x في الإشارة ، وانخفاض كبير في تكلفة الإنتاج ، وتحسن كبير في متانة الكواشف 6,7.
في البروتوكول ، وصفنا استخدام الجيل الثالث من مضان الحمض النووي الريبي الكامل HCR في طريقة التهجين في الموقع (HCR RNA WM-FISH) المصممة للكشف عن التوطين المكاني والتعبير عن أي جين 8,9. تستخدم هذه الطريقة المكونة من خطوتين أولا مجسات الحمض النووي الخاصة ب mRNA محل الاهتمام ، ولكنها تحتوي أيضا على تسلسل التعرف على البادئ. تستخدم الخطوة الثانية دبابيس الشعر الموسومة بالفلوروفور والتي ترتبط بتسلسل البادئ لتضخيم إشارة الفلورسنت (الشكل 1). تسمح هذه الطريقة أيضا بتعدد إرسال اثنين أو أكثر من مجسات الحمض النووي الريبي وتضخيم إشارات المسبار لتسهيل اكتشاف الحمض النووي الريبي وقياسه8. يوفر تصور وفرة النسخ وأنماط توطين الحمض النووي الريبي للجينات الحسية الكيميائية المعبر عنها في الزوائد الشمية السطر الأول من التبصر في وظائف الجينات الحسية الكيميائية وتشفير الرائحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتميز الجيل الثالث من تفاعل سلسلة التهجين (HCR) بحساسيته وقوته لتصور العديد من أهداف الحمض النووي الريبي8. تم استخدام HCR WM-FISH بنجاح على أجنة ذبابة الفاكهة والدجاج والفئران وسمك الزرد وكذلك يرقات الديدان الخيطية وسمك الزرد10،16،<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مارجو هير ومختبر ليزلي فوشال على مشاركة بروتوكول التهجين في الموقع لملاحق الزاعجة المصرية الشمية. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة إلى C.J.P. (NIAID R01Al137078) ، وزمالة HHMI Hanna Gray إلى JIR ، وجائزة مسرع جونز هوبكنز لما بعد الدكتوراه إلى JIR ، وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لأبحاث الملاريا إلى JIR. ونشكر معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا ومؤسسة بلومبرغ الخيرية على دعمهما.
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
