Summary

Rilevamento degli anticorpi IgG e IgM della rabbia utilizzando il test degli anticorpi fluorescenti indiretti della rabbia

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

Lo scopo di questo manoscritto è quello di esaminare l’uso del test degli anticorpi fluorescenti indiretti per la rabbia per la rilevazione di anticorpi IgG e IgM specifici per la rabbia.

Abstract

Il test degli anticorpi fluorescenti indiretti (IFA) per la rabbia è stato sviluppato per rilevare vari isotipi di anticorpi anti-rabbia specifici nei sieri o nel liquido cerebrospinale. Questo test fornisce risultati rapidi e può essere utilizzato per rilevare gli anticorpi antirabbici in diversi scenari. Il test antirabbico IFA è particolarmente utile per la diagnosi rapida e precoce degli anticorpi per valutare la risposta immunitaria in un paziente che ha sviluppato la rabbia. Sebbene altri metodi per la diagnosi di rabbia ante mortem abbiano la precedenza, questo test può essere utilizzato per dimostrare la recente esposizione al virus della rabbia attraverso il rilevamento degli anticorpi. Il test IFA non fornisce un titolo anticorpale neutralizzante il virus (VNA), ma la risposta della profilassi pre-esposizione (PrEP) può essere valutata attraverso la presenza di anticorpi positivi o negativi. Questo test può essere utilizzato in varie situazioni e può fornire risultati per una serie di obiettivi diversi. In questo studio, abbiamo utilizzato diversi campioni di siero accoppiati di individui che hanno ricevuto la PrEP e abbiamo dimostrato la loro presenza di anticorpi antirabbici nel tempo utilizzando il test IFA.

Introduction

Il test degli anticorpi fluorescenti indiretti (IFA) della rabbia viene utilizzato per rilevare vari isotipi di anticorpi specifici per la rabbia nei sieri o nel liquido cerebrospinale. Fa parte di un arsenale di test disponibili per il monitoraggio di un paziente con rabbia ante mortem. È particolarmente utile per la diagnosi precoce degli anticorpi per valutare la risposta immunitaria di un paziente all’infezione da rabbia. Se utilizzato in combinazione con altri test, l’anamnesi e lo stato di vaccinazione del paziente, il test IFA può aiutare a determinare l’esposizione al virus della rabbia o a un vaccino1. Poiché il test IFA misura le IgM e/o le IgG, i valori dell’anticorpo specifico possono indicare un lasso di tempo approssimativo dall’esposizione all’antigene1. Questo test può essere utile nelle applicazioni elencate o in altre non ancora esplorate.

Sono disponibili diversi test sierologici per la rabbia. Il test rapido di inibizione della concentrazione fluorescente (RFFIT), il test di neutralizzazione del virus degli anticorpi fluorescenti (FAVN) o le modifiche di questi sono i metodi principali per misurare gli anticorpi neutralizzanti il virus della rabbia (RVNA)1. Tuttavia, questi test non differenziano gli anticorpi IgM e IgG. Quando la differenziazione dell’isotipo anticorpale è importante nel monitoraggio della risposta immunitaria della rabbia, vengono utilizzati i test IFA della rabbia e il test ELISA (Rabies Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), che però non misurano le RVNA. Sebbene i test IFA ed ELISA possano essere utilizzati per determinare la presenza di anticorpi specifici per la rabbia in un campione, ci sono alcune differenze nel modo in cui vengono eseguiti. Il test IFA utilizza un virus vivo in coltura cellulare come substrato dell’antigene, mentre un tipico test ELISA per il rilevamento della rabbia utilizza una o più proteine virali. In un ambiente di laboratorio in cui il virus della rabbia può essere coltivato, il test IFA può essere eseguito più facilmente invece di acquistare o coltivare singole proteine virali per l’ELISA. Lo scopo del test e le informazioni raccolte dai risultati di qualsiasi test sierologico della rabbia devono essere presi in considerazione quando si determina quale scegliere2.

Le IgM sono le prime a rispondere, aumentando fino a quando non si osserva il cambio di classe intorno al giorno 28, a quel punto le IgG diventano l’anticorpo circolante3 predominante. Pertanto, le IgM sarebbero previste solo per un periodo di tempo limitato dopo l’esposizione al virus della rabbia o la vaccinazione. L’analisi sia del siero che del liquido cerebrospinale (CSF) può indicare se l’esposizione è avvenuta attraverso la vaccinazione, in cui gli anticorpi sarebbero visibili solo nel siero, o da un’infezione virale, che potenzialmente mostrerebbe anticorpi nel CSF1.

È stato stabilito che gli anticorpi antirabbici persistono per diversi anni dopo la profilassi pre-esposizione (PrEP)4. Il test IFA può essere uno strumento utile per dimostrarlo in diversi momenti successivi alla vaccinazione o all’esposizione.

Protocol

Il seguente protocollo è stato approvato per l’uso etico di campioni umani dal Wadsworth Center del Dipartimento della Salute dello Stato di New York per lo sviluppo di test, numero di approvazione del protocollo #03-019. 1. Sicurezza Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI), una protezione minima per gli occhi (occhiali o visiera), una mascherina chirurgica e guanti non in lattice. Assicurarsi che il personale sia vaccinato per la rabbia e ch…

Representative Results

Tutti i campioni di siero sono stati raccolti dai pazienti all’incirca nello stesso periodo di tempo dopo la PrEP. I campioni sono stati testati da cinque diversi pazienti nei seguenti momenti: 2 settimane dopo l’inoculazione finale del vaccino antirabbico, 6 mesi dopo la serie di vaccini antirabbici e 18 mesi dopo la serie di vaccini antirabbici. Ogni campione di siero è stato diluito in serie e classificato sia per la presenza di IgM che di IgG, come descritto nelle fasi 5.2 e 5.3 del protocollo. Il valore anticorpale…

Discussion

Il test IFA sfrutta un complesso antigene-anticorpo, consentendo a un sito di marcatura di visualizzare gli anticorpi specifici per la rabbia. Le cellule di neuroblastoma o BHK vengono seminate su vetrini da microscopio rivestiti in PTFE a più pozzetti e inoculate con il ceppo di laboratorio CVS-11 del virus della rabbia. Una volta che il monostrato è confluente e le cellule raggiungono l’infettività desiderata di circa il 50%, i vetrini vengono conservati fino al momento dell’uso6.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati al Wadsworth Center del Dipartimento della Salute dello Stato di New York per aver sostenuto questo progetto.

Materials

25x55mm glass cover slips Any
Acetone Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate Sigma-Aldrich F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate SeraCare 5230-0286
Aspirating pipette tip Any
BHK-21 Cells ATCC CCL-10
BION IFA Diluent MBL BION DIL-9993
Cell Culture water Sigma-Aldrich W3500 EGM
Coplin Jars Any
Fetal Bovine Serum  Sigma-Aldrich F2442 EGM
Fluorescent microscope with FITC filter Any
Glycerol Sigma-Aldrich G7893 Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent Fisher Scientific 23-043-158 IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine Sigma-Aldrich G-7513 EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate Sigma-Aldrich M0643 EGM
Mouse Neuroblastoma Cells ATCC CCL-131
Multi-well Teflon coating glass slides Any
PBS Any pH 7.6 
Penicillin Sigma P-3032 EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate Millipore Sigma 5100, 5500 or 6500
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761 EGM
Sodium Chloride crystals Sigma-Aldrich S5886 Mountant
Sterile dropper Any
Streptomycin sulfate salt Sigma S9137 EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0 Sigma-Aldrich S9693 Mountant
Tryptose Phosphate Broth BD 260300 EGM
Vitamin mix Sigma-Aldrich M6895 EGM

References

  1. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , 232-245 (2018).
  2. Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516 (2021).
  3. Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
  4. Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
  5. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
  6. Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
  7. Fooks, A. R., Jackson, A. C. . Rabies: scientific basis of the disease and its management. , (2020).
  8. Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
  9. Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
  10. Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
  11. Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).

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Cite This Article
Jones, N. J., Jarvis, J. A., Appler, K. A., Davis, A. D. Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test. J. Vis. Exp. (203), e65459, doi:10.3791/65459 (2024).

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