Spinal Kord Stimülasyonu Sırasında Motor Nöronlarda Tüm Hücre Yama-Klemp Kaydı için Omurilik Diliminin Ex vivo Hazırlanması
Summary
Bu protokol, motor nöronların omurilik stimülasyonuna (SCS) elektriksel tepkilerini yüksek uzay-zamansal çözünürlükle incelemek için bir yama kelepçesi kullanan bir yöntemi açıklar ve bu da araştırmacıların omuriliği ayırma ve aynı anda hücre canlılığını sürdürme becerilerini geliştirmelerine yardımcı olabilir.
Abstract
Omurilik stimülasyonu (SCS), omurilik yaralanması (SCI) sonrası lokomotor fonksiyonu etkili bir şekilde geri yükleyebilir. Motor nöronlar, sensorimotor davranışları yürüten son birim olduğundan, motor nöronların elektriksel tepkilerini SCS ile doğrudan incelemek, spinal motor modülasyonunun altında yatan mantığı anlamamıza yardımcı olabilir. Farklı uyaran özelliklerini ve hücresel tepkileri aynı anda kaydetmek için, bir yama kelepçesi, elektrofizyolojik özellikleri tek hücre ölçeğinde incelemek için iyi bir yöntemdir. Bununla birlikte, hücre canlılığını korumak, omuriliği kemikli yapıdan hızlı bir şekilde ayırmak ve aksiyon potansiyellerini başarılı bir şekilde indüklemek için SCS’yi kullanmak da dahil olmak üzere bu hedefe ulaşmada hala bazı karmaşık zorluklar vardır. Burada, motor nöronların yüksek uzay-zamansal çözünürlükle SCS’ye elektriksel tepkilerini incelemek için yama-kelepçe kullanarak ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, bu da araştırmacının omuriliği ayırma ve hücre canlılığını koruma becerilerini geliştirmelerine yardımcı olabilir.
Introduction
Omurilik stimülasyonu (SCS), omurilik yaralanması (SCI) sonrası lokomotor fonksiyonu etkili bir şekilde geri yükleyebilir. Andreas Rowald ve ark. SCS’nin tek bir gün içinde alt ekstremite lokomotor ve gövde fonksiyonunu sağladığını bildirmiştir1. Lokomotor geri kazanım için SCS’nin biyolojik mekanizmasını keşfetmek, daha kesin bir SCS stratejisi geliştirmek için kritik ve trend olan bir araştırma alanıdır. Örneğin, Grégoire Courtine’in ekibi, omurilikteki uyarıcı Vsx2 internöron ve Hoxa10 nöronlarının SCS’ye yanıt veren anahtar nöronlar olduğunu ve hücreye özgü nöromodülasyonun SCI2’den sonra sıçan yürüme yeteneğini geri kazanmak için mümkün olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, az sayıda çalışma, tek hücre ölçeğinde SCS’nin elektriksel mekanizmasına odaklanmaktadır. Klasik kalamar deneyi 3,4,5’te eşik üstü doğru akım uyaranının aksiyon potansiyellerini (AP’ler) ortaya çıkarabileceği iyi bilinmesine rağmen, SCS gibi darbeli alternatif elektriksel stimülasyonun motor sinyal üretimini nasıl etkilediği hala belirsizdir.
İntraspinal nöral devrelerin karmaşıklığı göz önüne alındığında, SKS’nin elektriksel mekanizmasının araştırılmasında hücre popülasyonu için uygun seçim önemlidir. SCS, propriyoseptif yol6’yı aktive ederek motor fonksiyonunu geri yüklese de, motor nöronlar, propriyosepsiyon bilgisi afferent girdisinin7 entegre edilmesinden türetilen motor komutu yürüten son birimdir. Bu nedenle, SCS ile motor nöronların elektriksel özelliklerini doğrudan incelemek, spinal motor modülasyonun altında yatan mantığı anlamamıza yardımcı olabilir.
Bildiğimiz gibi, yama kelepçesi, son derece yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip hücresel elektrofizyolojik kayıt için altın standart yöntemdir8. Bu nedenle, bu çalışma, motor nöronların SCS’ye elektriksel tepkilerini incelemek için bir yama kelepçesi kullanan bir yöntemi açıklamaktadır. Beyin yama kelepçesi9 ile karşılaştırıldığında, omurilik yama kelepçesi aşağıdaki nedenlerden dolayı daha zordur: (1) Omurilik, daha iyi hücre canlılığı elde etmek için çok ince mikromanipülasyon ve titiz buz gibi bakım gerektiren küçük hacimli vertebral kanal tarafından korunur. (2) Omurilik, kesme tepsisine sabitlenemeyecek kadar ince olduğundan, düşük erime noktalı agaroza daldırılmalı ve katılaşmadan sonra kesilmelidir.
Bu nedenle, bu yöntem, SCS’nin motor nöronlar üzerindeki elektriksel mekanizmasını sorunsuz bir şekilde incelemek ve gereksiz denemelerden ve hatalardan kaçınmak için omuriliğin diseke edilmesinde ve aynı zamanda hücre canlılığının korunmasında teknik ayrıntılar sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
SCS tarafından modüle edilen hareket bilgisi sonunda motor nöronlara yakınsar. Bu nedenle, motor nöronları araştırma hedefi olarak almak, çalışma tasarımını basitleştirebilir ve SKS’nin nöromodülasyon mekanizmasını daha doğrudan ortaya çıkarabilir. Farklı uyaran özelliklerini ve hücresel tepkileri aynı anda kaydetmek için, bir yama kelepçesi, elektrofizyolojik özellikleri tek hücre ölçeğinde incelemek için iyi bir yöntemdir. Bununla birlikte, hücre canlılığının nasıl korunacağı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Genç Akademisyenler için Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (52207254 ve 82301657) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Fonu (2022M711833) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
