Summary

La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale

Published: September 08, 2023
doi:

Summary

Questo protocollo descrive un metodo che utilizza un patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla stimolazione del midollo spinale (SCS) con un’elevata risoluzione spazio-temporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere contemporaneamente la vitalità cellulare.

Abstract

La stimolazione del midollo spinale (SCS) può ripristinare efficacemente la funzione locomotoria dopo una lesione del midollo spinale (SCI). Poiché i motoneuroni sono l’unità finale per eseguire i comportamenti sensomotori, studiare direttamente le risposte elettriche dei motoneuroni con SCS può aiutarci a comprendere la logica sottostante della modulazione motoria spinale. Per registrare simultaneamente diverse caratteristiche di stimolo e risposte cellulari, un patch-clamp è un buon metodo per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche su scala di singola cellula. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà complesse nel raggiungere questo obiettivo, tra cui il mantenimento della vitalità cellulare, la rapida separazione del midollo spinale dalla struttura ossea e l’utilizzo dell’SCS per indurre con successo potenziali d’azione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che utilizza patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni a SCS con un’elevata risoluzione spaziotemporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere la vitalità cellulare allo stesso tempo per studiare senza problemi il meccanismo elettrico di SCS sul motoneurone ed evitare inutili tentativi ed errori.

Introduction

La stimolazione del midollo spinale (SCS) può ripristinare efficacemente la funzione locomotoria dopo una lesione del midollo spinale (SCI). Andreas Rowald et al. hanno riportato che la SCS consente la funzione locomotoria e del tronco degli arti inferiori entro un solo giorno1. L’esplorazione del meccanismo biologico della SCS per il recupero locomotore è un campo di ricerca critico e di tendenza per lo sviluppo di una strategia SCS più precisa. Ad esempio, il team di Grégoire Courtine ha dimostrato che l’interneurone eccitatorio Vsx2 e i neuroni Hoxa10 nel midollo spinale sono i neuroni chiave per la risposta alla SCS e la neuromodulazione cellulo-specifica è fattibile per ripristinare la capacità di camminare del ratto dopo la lesione midollare2. Tuttavia, pochi studi si concentrano sul meccanismo elettrico della SCS su scala di una singola cellula. Sebbene sia ben noto che lo stimolo in corrente continua soprasoglia può suscitare i potenziali d’azione (AP) nel classico esperimento del calamaro 3,4,5, non è ancora chiaro come la stimolazione elettrica alternata pulsata, come la SCS, influenzi la generazione del segnale motorio.

Data la complessità dei circuiti neurali intraspinali, una selezione appropriata per la popolazione cellulare è importante per studiare il meccanismo elettrico della SCS. Sebbene la SCS ripristini la funzione motoria attivando la via propriocettiva6, i motoneuroni sono l’unità finale per eseguire il comando motorio, derivato dall’integrazione dell’input afferente alle informazioni sulla propriocezione7. Pertanto, studiare direttamente le caratteristiche elettriche dei motoneuroni con SCS può aiutarci a comprendere la logica sottostante alla modulazione motoria spinale.

Come sappiamo, il patch-clamp è il metodo gold standard per la registrazione elettrofisiologica cellulare con una risoluzione spazio-temporale estremamente elevata8. Pertanto, questo studio descrive un metodo che utilizza un patch clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla SCS. Rispetto al cerotto cerebrale9, il cerotto per il midollo spinale è più difficile per i seguenti motivi: (1) Il midollo spinale è protetto dal canale vertebrale con un volume minuscolo, che richiede una micromanipolazione molto fine e una rigorosa manutenzione ghiacciata per ottenere una migliore vitalità cellulare. (2) Poiché il midollo spinale è troppo sottile per essere fissato sul vassoio di taglio, deve essere immerso in agarosio a basso punto di fusione e tagliato dopo la solidificazione.

Quindi, questo metodo fornisce dettagli tecnici nella dissezione del midollo spinale e nel mantenimento della vitalità cellulare allo stesso tempo, in modo da studiare senza problemi il meccanismo elettrico della SCS sui motoneuroni ed evitare inutili prove ed errori.

Protocol

Il Comitato Istituzionale per la Cura e l’Uso degli Animali ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali e gli studi sono stati condotti in conformità con le normative vigenti in materia di benessere degli animali. 1. Preparazione degli animali AnimaliInformazioni sull’alloggiamento: Ratti Sprague-Dawley maschi (10-14 giorni postnatali, P10-P14) in un ambiente specifico privo di agenti patogeni.NOTA: Le condizioni ambientali sono state mantenute a 20…

Representative Results

Grazie al rigoroso mantenimento a bassa temperatura durante l’operazione fine (Figura 1 supplementare, Figura 2 supplementare e Figura 1), la vitalità cellulare è stata sufficiente per eseguire successive registrazioni elettrofisiologiche. Per simulare il più possibile lo scenario clinico, abbiamo utilizzato la micromanipolazione per posizionare il catodo e l’anodo SCS vicino alla linea mediana dorsale e DREZ, rispettivamente (Figura 2), che …

Discussion

Le informazioni di movimento modulate da SCS vengono infine condivise nei motoneuroni. Pertanto, prendere i motoneuroni come obiettivo di ricerca può semplificare il disegno dello studio e rivelare il meccanismo di neuromodulazione della SCS in modo più diretto. Per registrare simultaneamente diverse caratteristiche di stimolo e risposte cellulari, un patch-clamp è un buon metodo per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche su scala di singola cellula. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà, tra cui come m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 e 82301657) e dal China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).

Materials

Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Ascorbic Acid Sigma A4034
CaCl2·2H2O Sigma C5080
Choline Chloride Sigma C7527
Cover slide tweezers VETUS 36A-SA Clip a slice
D-Glucose Sigma G8270
EGTA Sigma E4378
Fine scissors RWD Life Science S12006-10 Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source Olympus  U-HGLGPS
Fluoro-Gold Fluorochrome Fluorochrome Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877
HEPES Sigma H3375
infrared CCD camera Dage-MTI IR-1000E
KCl Sigma P5405
K-gluconate Sigma P1847
Low melting point agarose Sigma A9414
MgSO4·7H2O Sigma M2773
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-200
Micropipette puller Sutter instrument P1000
Micro-scissors  Jinzhong wa1020 Laminectomy
Microscope for anatomy Olympus  SZX10
Microscope for ecletrophysiology Olympus  BX51WI
Micro-toothed tweezers RWD Life Science F11008-09 Lift the cut vertebral body
NaCl Sigma S5886
NaH2PO4 Sigma S8282
NaHCO3 Sigma V900182
Na-Phosphocreatine Sigma P7936
Objective lens for ecletrophysiology Olympus  LUMPLFLN60XW working distance 2 mm 
Osmometer  Advanced  FISKE 210
Patch-clamp amplifier  Axon  Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer Axon  Digidata 1550B
pH meter  Mettler Toledo  FE28
Slice Anchor Multichannel system SHD-27H
Spinal cord stimulatior PINS T901
Toothed tweezer RWD Life Science F13030-10 Lift the xiphoid
Vibratome Leica VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter Olympus  U-MF2

References

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Cite This Article
Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L. The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation. J. Vis. Exp. (199), e65385, doi:10.3791/65385 (2023).

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