Summary

Injeções intracerebroventriculares à mão livre em camundongos

Published: January 12, 2024
doi:

Summary

Aqui, uma abordagem simples e rápida para a realização de injeções intracerebroventriculares em camundongos usando uma abordagem à mão livre (ou seja, sem um dispositivo estereotáxico) é descrita.

Abstract

A investigação de sistemas neuroendócrinos muitas vezes requer a entrega de drogas, vírus ou outros agentes experimentais diretamente no cérebro de camundongos. Uma injeção intracerebroventricular (ICV) permite a entrega generalizada do agente experimental em todo o cérebro (particularmente nas estruturas próximas aos ventrículos). Aqui, métodos para fazer injeções de ICV à mão livre em camundongos adultos são descritos. Usando pontos de referência visuais e táteis nas cabeças de camundongos, as injeções nos ventrículos laterais podem ser feitas de forma rápida e confiável. As injeções são feitas com uma seringa de vidro mantida na mão do experimentador e colocada a distâncias aproximadas dos pontos de referência. Assim, esta técnica não requer um quadro estereotáxico. Além disso, essa técnica requer apenas uma breve anestesia com isoflurano, o que permite a avaliação subsequente do comportamento e/ou fisiologia de camundongos em camundongos acordados e com comportamento livre. A injeção de ICV à mão livre é uma ferramenta poderosa para a entrega eficiente de agentes experimentais no cérebro de camundongos vivos e pode ser combinada com outras técnicas, como amostragem frequente de sangue, manipulação de circuitos neurais ou gravação in vivo para investigar processos neuroendócrinos.

Introduction

A entrega de agentes experimentais, como drogas1, vírus2 ou células3, ao cérebro é muitas vezes necessária para a pesquisa neuroendócrina. Se o agente não atravessar prontamente a barreira hematoencefálica ou o objetivo experimental for testar especificamente os efeitos centrais do agente, é importante ter um método confiável para administrar injeções no cérebro. Além disso, a injeção no espaço intracerebroventricular (ICV) oferece a oportunidade de distribuir amplamente o agente no cérebro e fornece uma grande área alvo, aumentando assim a probabilidade de injeção bem-sucedida2.

Um método comum para fazer injeções de ICV envolve a colocação de uma cânula de permanência permanente. Nesta abordagem, uma estrutura estereotáxica é necessária para posicionar a cânula comercialmente disponível ou feita sob medida, pois a cânula é colada ou cimentada no lugar. Muitas vezes, após a recuperação, uma dose suprafisiológica de angiotensina II é administrada através da cânula e, se o comportamento de beber for imediatamente observado, a cânula é considerada corretamente colocada4. Esta abordagem tem muitas vantagens, incluindo a capacidade de realizar infusão a longo prazo e a capacidade de injetar o mesmo animal várias vezes; além disso, se a angiotensina II for empregada, o posicionamento correto pode ser confirmado antes da administração de compostos experimentais. No entanto, existem algumas limitações para a colocação de uma cânula permanente, incluindo a necessidade de equipamentos caros (estrutura estereotáxica), a possibilidade de danos à cânula após a colocação (por exemplo, ratos podem mastigar a cânula de um companheiro de gaiola) e a possibilidade de infecções ao redor da cânula permanente. Injeções únicas de VCI podem ser feitas com o uso de um quadro estereotáxico3, que, embora eficaz, requer exposição substancial à anestesia e, portanto, pode obscurecer alguns efeitos fisiológicos e comportamentais agudos do tratamento. Além disso, a colocação de camundongos em um quadro estereotáxico requer treinamento substancial para alcançar uma colocação estável e evitar o rompimento dos canais auditivos.

Aqui, um método estabelecido para fazer injeções à mão livre em camundongos é descrito. Esse método é baseado em relatos anteriores 5,6. As vantagens dessa técnica são que ela é simples, rápida e não requer equipamentos especializados, como uma armação estereotáxica. Como descrito a seguir, esse procedimento envolve a manipulação de uma seringa de vidro em relação a pontos na cabeça do camundongo para fazer as injeções, o que pode ser feito rapidamente e, portanto, requer apenas alguns minutos de anestesia gasosa no dia do experimento.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Colorado State University (#3960) e da University of California San Diego, onde os dados representativos foram coletados (S13235, PI Kellie Breen Church). Os dados de cinco camundongos adultos fêmeas e dois machos adultos C57/BL6 (9-16 semanas de idade) são mostrados na seção de dados representativos. Camundongos fêmeas foram ovariectomizados 3-4 semanas antes da injeção de ICV e coleta de sangue, como descrito ant…

Representative Results

Quando realizada com sucesso, essa técnica permite a rápida liberação de um agente experimental no sistema ventricular. Um perfil de pulso do hormônio luteinizante (LH) de uma camundongo ovariectomizada que recebeu uma injeção ICV de 3 μL de solução salina isotônica estéril, o veículo para muitos compostos farmacológicos, é mostrado na Figura 2A. Este exemplo demonstra que a breve exposição à anestesia gasosa e a injeção isolada de 3 μL de líquido no sistema ventricular…

Discussion

Aqui, um meio simples e eficaz para fazer injeções de ICV em camundongos é descrito. Uma vez que esta técnica não requer uma estrutura estereotáxica, esta abordagem para a entrega central de drogas e agentes experimentais é acessível a mais pesquisadores. Além disso, essa abordagem é relativamente alta, uma vez que o procedimento de preparação e injeção pode ser realizado rapidamente.

Como esse procedimento requer a manipulação manual de agulhas e seringas de vidro utilizando d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer à Dra. Kellie Breen Church, ao Sr. Michael Kreisman e à Sra. Jessica Jang por suas contribuições para a coleta dos dados mostrados nos resultados representativos. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).

Materials

18-gauge blunt needles SAI Infusion B18-150
18-gauge needles BD Medical 305195
Alcohol pads Fisher Scientific 22-363-750
Bench pad Fisher Scientific 14-206-62AC22
Betadine solution Fisher Scientific NC1696484
Buprenorphine Patterson Vet Supply 07-892-5235 Controlled substance
Eyelube Fisher Scientific 50-218-8442
Glass syringe Hamilton 7634-01
Injection needle Hamilton 7803-01 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45
Isoflurane   Patterson Vet Supply 07-893-8441
Isoflurane vaporizer Vet Equip V-10
Laboratory Tape VWR 89098-128
Medical grade oxygen Airgas OX USPEA
Paraformaldehyde Millipore-Sigma 8.18715.1000
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific J67802.K2
PulsaR Software Open source, University of Otago See ref 9
Ruler Fisher Scientific 12-00-152
Silastic tubing (0.040" I.D.) DOW 508-005
Silastic tubing (0.078" I.D.) DOW 508-009
Sterile saline VWR 101320-574
Sucrose  Fisher Scientific S5-500

References

  1. Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
  2. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  3. Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
  4. Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
  5. Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
  6. Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
  7. McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
  8. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
  9. Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
  10. Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
  11. Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
  12. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  13. Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).

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Cite This Article
McCosh, R. B., Young, L. A. Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice. J. Vis. Exp. (203), e65324, doi:10.3791/65324 (2024).

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