该协议演示了使用DNA折纸纳米天线(DONA)结合共定位原子力显微镜(AFM)和拉曼测量的单分子表面增强拉曼散射(SERS)测量。
表面增强拉曼散射(SERS)能够检测需要高场增强的单个分子。单分子(SM)SERS能够提供关于单个分子的分子特异性光谱信息,因此比其他SM检测技术产生更详细的化学信息。同时,有可能从SM测量中解开隐藏在散装材料拉曼测量中的信息。该协议概述了使用DNA折纸纳米天线(DONA)结合原子力显微镜(AFM)和拉曼光谱的SM SERS测量。DNA折纸叉结构和两个金纳米颗粒结合形成DONA,它们之间的间隙为1.2-2.0 nm。这允许多达 10 个11 倍 SERS 信号增强,从而能够测量单个分子。该协议进一步展示了单个分析物分子在SERS热点中的位置,AFM成像过程以及随后的拉曼成像叠加以测量单个DONA中的分析物。
DNA折纸是一种纳米技术,涉及将DNA链折叠成特定的形状和图案。在纳米尺度上创建精确控制结构的能力是DNA折纸1的关键优势之一。在如此小的范围内操纵物质的能力有可能彻底改变广泛的领域,包括医学,电子学和材料科学2。例如,DNA折纸结构已被用于将药物直接输送到癌细胞3,4,制造用于检测疾病的纳米级传感器5,6,并在材料表面创建复杂的图案6,7。此外,使用DNA折纸创建复杂纳米级结构的能力为研究纳米级基础生物过程创造了新的机会8。
表面增强拉曼散射(SERS)是一种强大的分析技术,可检测和鉴定极低浓度的分子9。它基于拉曼效应,拉曼效应是散射光波长的变化10。SERS需要等离子体金属基底来增强吸附在其上的分子的拉曼信号。这种增强功能比传统拉曼光谱测量的同一分子获得的信号高10 11倍,使SERS成为分析痕量物质的高灵敏度方法11。
纳米粒子的拉曼信号增强主要是由于基于局部表面等离子体共振(LSPR)激发的电磁增强12。在这种现象中,金属纳米颗粒内的电子在入射光期间围绕金属纳米颗粒的表面集体振荡。这导致产生称为表面等离子体的电子驻波,它可以与入射光共振。LSPR极大地增强了粒子表面附近的电场,并且在等离激元共振频率下粒子的光吸收最大。表面等离子体的能量取决于金属纳米颗粒的形状和大小,以及周围介质的性质13。等离子体耦合可以进一步实现更高的增强,例如当两个纳米颗粒在直径长度的约2.5倍或更小14的距离上彼此靠近时。这种接近导致两个纳米粒子的LSPR相互作用,将粒子之间间隙中的电场增强几个数量级,远远超过单个纳米粒子的增强15,16,17。增强的幅度与纳米颗粒之间的距离成反比;随着距离的减小,会出现一个临界点,其中增强足以检测单分子(SMs)18。
DNA折纸代表了一种关键技术,可以有效地排列等离子体纳米颗粒,以开发和优化等离子体耦合19。同时,目标分子可以精确地放置在光学检测最有效的位置。这已经通过用于荧光检测的基于DNA折纸的等离子体纳米天线20得到证明。与荧光标记的检测相比,SERS提供了检测分子的直接化学指纹的可能性,这使得单分子SERS在传感以及监测化学反应和机理研究方面非常有吸引力。DNA折纸也可以用作掩模来制造具有明确形状的等离子体纳米结构21,尽管随后失去了将目标分子精确定位到热点中的可能性。
使用共定位原子力显微镜(AFM)和拉曼测量,我们可以从单个DNA折纸纳米天线(DONA)获得拉曼光谱,如果放置在信号增强最高的位置,则可能获得单个分子。DONA包括一个DNA折纸叉和两个精确定位的纳米颗粒,完全涂有DNA与附着在DNA折纸上的延伸钉链互补。在DNA杂交时,纳米颗粒与DNA折纸叉结合,纳米颗粒表面之间有1.2-2.0nm的间隙22。根据有限差分时域(FDTD)模拟22计算,这种组装在纳米颗粒之间产生一个信号增强高达1011倍的热点,从而允许SM SERS测量。然而,最高增强的体积很小(在1-10nm3范围内),因此需要将目标分子精确定位到该热点中。DNA折纸叉允许使用DNA叉桥和适当的偶联化学在两个纳米颗粒之间定位单个分子。然而,在拉曼光谱中观察这种SM是非常具有挑战性的22。或者,纳米颗粒可以完全涂覆目标分子,例如 TAMRA 染料,以允许以更高的 SERS 强度进行单次 DONA 测量21。在这种情况下,TAMRA共价连接到DNA包被链上(图1)。
SM SERS 是一种强大的工具,允许研究人员研究样品中单个分子的行为和相互作用1.这种技术允许以前所未有的灵敏度分析系统,为单个分子的基本行为以及分子集合中化学或物理性质的分布提供新的见解,并有助于识别化学过程中的相关中间体。然而,将单个分子放置在热点中,同时确保热点具有足够的表面增强可能非常具有挑战性27。该协议中描述的 DONA 可以精确地将单个分子放置在两个金纳米颗粒之间的热点中,同时确保达到 1011 倍的表面增强。
纳米颗粒之间的间隙对于 DONA 组件达到 SM SERS 研究所需的表面增强至关重要。DONA 针对尺寸在 60 到 80 nm 之间的球形纳米颗粒进行了优化。此外,纳米颗粒的质量可以显着影响纳米颗粒与DNA折纸叉的杂交;当涂覆步骤中使用的纳米颗粒超过6个月时,杂交效率开始下降。
该协议的另一个关键方面是,必须精确遵循需要组分之间精确比例的步骤,否则 DONA 将无法正确形成。DNA折纸叉对升温方案非常敏感,变化会影响结构的完整性或防止叉子的形成。
在SERS测量过程中,无定形碳生成是一个重要问题,因为它的峰通常与许多分子的指纹图谱面积(1,200-1,700 cm-1)处于同一范围内。虽然这种形成尚未完全了解,但它通常与高激光功率或长积分时间有关28。作为预防措施,应使用尽可能低的激光功率和最短的积分时间。然而,这并不容易实现,因为必须在获得所需的SERS信号和避免产生无定形碳之间取得平衡。
DONA作为SM系统非常通用,涉及可以使用的不同类型和形状的纳米颗粒,例如银球,金花或星星。此外,所研究的分子可以通过仅改变桥中间的DNA链来轻松替换,而无需改变程序。切换到细胞色素C等蛋白质可以通过在桥中具有吡啶修饰的DNA捕获链来完成,该捕获链将结合细胞色素C并确保它处于SM SERS测量的热点22。这也意味着灵活地选择用于照射的激光器,可能使用可提供最大增强效果的激光器。
总之,该方法对于组装DONA结构并将其用于单分子表面增强拉曼光谱测量是可靠的。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了欧洲研究理事会(ERC;合并者拨款第772752号)的支持。
100 kDa MWCO Amicon filters, 0.5 mL | Merck | UFC5100BK | |
10x TAE buffer (0.4 M Tris, 0.2 M acetic acid, 0.01 M EDTA) | SIGMA Aldrich | T9650 | |
60 nm goldspheres, bare (citrate) | NanoComposix | AUCN60 | |
ACCESS-NC-A AFM probes | SCHAEFER-TEC | ||
Agarose powder | SIGMA Aldrich | 9012-36-6 | |
AuNP DNA coating strands | IDT | ||
AuNP DNA coating strands (TAMRA) | SIGMA Aldrich | ||
Glycerol | SIGMA Aldrich | 56-81-5 | |
Heraeus Fresco 17 centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
HORIBA OmegaScope with a LabRAM HR evolution | HORIBA | ||
Magnesium chloride | SIGMA Aldrich | 7786-30-3 | |
Nanofork DNA bridge strand (TAMRA) | Metabion | ||
Nanofork DNA staple strands | SIGMA Aldrich | ||
ParafilmM | Carl Roth | CNP8.1 | |
Primus 25 Thermocycler | Peqlab/VWR | ||
Silicon wafer | Siegert wafer | BW14076 | |
Single-stranded scaffold DNA, type p7249 (M13mp18) | Tilibit nanosystems | ||
TCEP solution | SIGMA Aldrich | 51805-45-9 |