Summary

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Published: August 18, 2023
doi:

Summary

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Immunfluoreszenz wird häufig für ihre Visualisierung verwendet. Es gibt jedoch verschiedene Färbeprotokolle, und in vielen Fällen wird nur eine Art von Gewebe untersucht. Hier etablieren wir ein allgemein anwendbares Protokoll für die Färbung von NETs in Maus und menschlichem Gewebe.

Abstract

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden von Neutrophilen als Reaktion auf bakterielle Infektionen oder traumatische Gewebeschäden freigesetzt, spielen aber auch eine Rolle bei Autoimmunerkrankungen und sterilen Entzündungen. Es handelt sich um netzartige Strukturen, die aus doppelsträngigen DNA-Filamenten, Histone und antimikrobiellen Proteinen bestehen. Einmal freigesetzt, können NETs extrazelluläre Krankheitserreger in Blut und Gewebe einfangen und abtöten. Darüber hinaus sind NETs an der homöostatischen Regulation beteiligt, indem sie die Adhäsion und Koagulation von Blutplättchen stimulieren. Die dysregulierte Produktion von NETs wurde jedoch auch mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Sepsis oder Autoimmunerkrankungen, was sie zu einem vielversprechenden Ziel für therapeutische Interventionen macht. Neben der Elektronenmikroskopie ist die Visualisierung von NETs mittels Immunfluoreszenz-Bildgebung derzeit eine der wenigen bekannten Methoden, um NET-Wechselwirkungen im Gewebe nachzuweisen. Daher wurden verschiedene Färbemethoden zur Visualisierung von NETs eingesetzt. In der Literatur werden verschiedene Färbeprotokolle beschrieben, und wir haben vier Schlüsselkomponenten identifiziert, die eine hohe Variabilität zwischen den Protokollen aufweisen: (1) die Art der verwendeten Antikörper, (2) die Verwendung von Autofluoreszenz-reduzierenden Mitteln, (3) Antigen-Retrieval-Methoden und (4) Permeabilisierung. Daher wurden in dieser Arbeit in vitro Immunfluoreszenz-Färbeprotokolle systemisch angepasst und verbessert, um sie für verschiedene Spezies (Maus, Mensch) und Gewebe (Haut, Darm, Lunge, Leber, Herz, Bandscheibe) anwendbar zu machen. Nach der Fixierung und Paraffineinbettung wurden 3 μm dicke Schnitte auf Objektträger montiert. Diese Proben wurden mit primären Antikörpern gegen Myeloperoxidase (MPO), citrulliniertes Histon H3 (H3cit) und neutrophile Elastase (NE) nach einem modifizierten Färbeprotokoll gefärbt. Die Objektträger wurden mit Sekundärantikörpern gefärbt und mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Ergebnisse wurden anhand eines Bewertungsbogens analysiert und Unterschiede semi-quantitativ erfasst.

Hier stellen wir ein optimiertes NET-Färbeprotokoll vor, das für verschiedene Gewebe geeignet ist. Wir verwendeten einen neuartigen Primärantikörper zur Färbung von H3cit und reduzierten die unspezifische Färbung mit einem Autofluoreszenz-reduzierenden Mittel. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die NET-Färbung eine konstant hohe Temperatur und einen sorgfältigen Umgang mit den Proben erfordert.

Introduction

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) wurden erstmals 2004 von Brinkmann et al. als ein Weg des Zelltods visualisiert, der sich von Apoptose und Nekrose unterscheidet1. Auf diesem Weg geben Neutrophile ihr dekondensiertes Chromatin in den extrazellulären Raum ab, um große netzartige Strukturen zu bilden, die mit antimikrobiellen Proteinen bedeckt sind, die zuvor in den Granula oder dem Zytosol gespeichert waren. Zu diesen antimikrobiellen Proteinen gehören neutrophile Elastase (NE), Myeloperoxidase (MPO) und citrulliniertes Histon H3 (H3cit), die üblicherweise für den indirekten Immunfluoreszenznachweis von NETsverwendet werden 2. Diese Methode identifiziert nicht nur das quantitative Vorhandensein dieser Proteine; in der Tat hat es den Vorteil, NET-ähnliche Strukturen spezifisch zu detektieren. In den NETs kolokalisieren die genannten Proteine mit extrazellulärer DNA, was durch eine Überlappung der Fluoreszenzsignale jedes gefärbten Proteins und der extrazellulären DNA nachgewiesen werden kann. Im Gegensatz zu den überlappenden Signalen, die auf die Kolokalisation von extrazellulärer DNA und Proteinen in NETs zurückzuführen sind, zeigen intakte Neutrophile keine Kolokalisation. Hier werden die NET-Komponenten in der Regel getrennt in den Granula, Zellkernen und Zytosol3 gelagert.

Seit ihrer ersten Entdeckung hat sich gezeigt, dass NETs bei zahlreichen Krankheiten, insbesondere bei Entzündungen, eine zentrale Rolle spielen. NETs zeigen antimikrobielle Funktionen während der Infektion, indem sie extrazelluläre Krankheitserreger in Blut und Gewebe einfangen und abtöten 4,5. NETs wurden jedoch auch mit Autoimmunerkrankungen und hyperinflammatorischen Reaktionen wie systemischem Lupus erythematodes, rheumatischer Arthritis und allergischem Asthma in Verbindung gebracht 6,7,8. NETs fördern Vaso-Verschluss und Entzündung bei Atherosklerose, Thrombozytenadhäsion und es wird spekuliert, dass sie eine Rolle bei metastasierendem Krebs spielen 9,10,11. Dennoch wird angenommen, dass sie entzündungshemmende Eigenschaften haben, indem sie den proinflammatorischen Zytokinspiegel senken12. Während NETs in einem breiteren Forschungsfeld immer mehr an Interesse gewinnen, ist eine robuste NET-Detektionsmethode für die zukünftige Forschung von grundlegender Bedeutung.

Auch wenn die Visualisierung von NETs in verschiedenen Geweben mittels Immunfluoreszenz-Bildgebung komplex ist und angepasst werden muss, ist sie neben der Elektronenmikroskopie derzeit eine der renommiertesten Methoden zur Visualisierung der Wechselwirkungen zwischen NETs und Zellen und wird überwiegend in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben (FFPE) eingesetzt13,14. Der Vergleich der NET-Bildgebung ist jedoch schwierig, da verschiedene Labore ihre eigenen maßgeschneiderten Protokolle verwenden. Diese Protokolle unterscheiden sich in der Verwendung von Antikörpern, der Antigengewinnung oder der Permeabilisierungsmethode und sind oft für einen bestimmten Gewebetyp optimiert 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

Nachdem Brinkmann et al. die erste methodische Studie mit immunfluoreszierender Visualisierung von NETs in FFPE-Gewebe veröffentlicht hatten, wollten wir dieses Protokoll für eine größere Vielfalt von Geweben und Spezies optimieren15. Um ein breit anwendbares Immunfluoreszenzprotokoll zu etablieren, testeten wir verschiedene modifizierte Protokolle aus Studien, die Immunfluoreszenzmethoden in FFPE-Gewebe zum Nachweis von NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 verwendeten. 26,27. Darüber hinaus haben wir einen neuen H3cit-Antikörper für eine spezifischere extrazelluläre Färbung ausprobiert28. Wir stellen die Hypothese auf, dass durch die systematische Anpassung aktueller Färbeprotokolle an verschiedene Spezies und Gewebe die In-vitro-Bildgebung verbessert werden kann, was zu einer besseren Darstellung der Interaktion zwischen Neutrophilen und NETs sowohl lokal als auch systemisch führt.

Protocol

Diese Studie umfasste Mausgewebe aus Experimenten, die von der Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, genehmigt wurden (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Bei den verwendeten Geweben handelte es sich um Maus, Lunge und Dickdarm aus einem septischen Modell und verbrannte Haut. Wir haben 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse verwendet. Bei allen Versuchen wurde die europäische Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere befolgt. Die anonymisierten menschl…

Representative Results

Bevor wir mit unserer Protokolloptimierung begannen, identifizierten wir die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Färbung, indem wir in PubMed nach Studien suchten, die FFPE-Gewebe für die Immunfärbung von NETs verwendeten, und ihre Protokolle verglichen. Die erfolgversprechendsten Protokollunterschiede wurden als Schlüsselschritte für die Protokolloptimierung identifiziert, während Schritte, die größtenteils miteinander korrespondierten, nicht verändert wurden (Tabelle 1). <p class="…

Discussion

In dieser Arbeit zielten wir darauf ab, die bestehenden Protokolle für die Bildgebung von NETs an weitere Gewebetypen anzupassen und zu optimieren, beginnend mit dem eigentlichen Färbeprozess. Der erste kritische Schritt für diese Methode ist die Auswahl der am besten geeigneten Antikörper. Für NE haben wir einen NE-Antikörper von einem Mauswirt auf menschlichem Gewebe getestet, der im Vergleich zu NE von einem Kaninchenwirt keine zuverlässige Färbung zeigte. Darüber hinaus schlugen Thålin et al. H3cit (R8) als…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BO5534) ins Leben gerufen. Wir danken Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer und PD Dr. Ingo Königs für die Bereitstellung von Mustern. Darüber hinaus danken die Autoren dem Team der UKE Microscopy Imaging Facility (Core Facility, UKE Medical School) für die Unterstützung bei der Immunfluoreszenzmikroskopie.

Materials

         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

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Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

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