지카 바이러스 억제제를 실시간으로 평가하기 위한 세포 기반 전기 임피던스 플랫폼

설명된 모든 단계는 생물 안전 레벨 2 실험실의 층류 캐비닛에서 무균 조건에서 수행됩니다. 사용된 모든 바이러스는 벨기에 기관 검토 위원회(Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, 프로토콜 SBB 219 2011/0011) 및 KU Leuven의 생물안전 위원회의 규칙에 따라 승인된 대로 획득 및 사용되었습니다. 1. 세포 배양 유지 참고: 이 프로토콜은 다양한 세포주를 선택하여 수행되지만 물론 모든 부착 세포주에 적용할 수 있으며 세포 파종 밀도 최적화만 필요합니다. A549 인간 폐 선암 세포주, U87 인간 악성 교모세포종 세포주, 및 HEL 299 인간 배아 폐 섬유아세포를 T75 배양 플라스크에서 37°C 및 5%CO2 가습 인큐베이터에서 성장시켰다. 80%-95% 밀도로 세포를 계대 배양합니다. 모든 시약은 세포를 배양하기 전에 실온(RT)에 있어야 합니다. 세포로부터 컨디셔닝된 배양 배지를 제거한다. Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL를 사용하여 세포 단층을 한 번 세척합니다. 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1mL를 세포 단층 위에 골고루 분배합니다. 그런 다음 세포가 분리되기 시작할 때까지 37°C에서 최대 3분 동안 배양합니다. 9mL의 신선하고 완전한 성장 배지를 추가합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 피펫을 부드럽게 위아래로 움직여 세포를 다시 정지시킵니다. 원하는 부피의 세포 현탁액을 새로운 T75 배양 플라스크에 옮기고 적절한 부피의 신선한 성장 배지를 첨가하여 총 부피 15mL를 얻습니다.참고: 이 프로토콜에 사용된 시험관 내 세포주는 이상적인 성장 조건을 허용하기 위해 특정 세포주에 따라 1:4에서 1:10 희석으로 계대 배양됩니다. 계대 배양은 3-4 일마다 수행되므로 원하는 세포 현탁액의 양은 배양 일수에 따라 달라질 수 있습니다. 2. CEI 플레이트의 제조 interdigitated 전극이 있는 96웰 플레이트( 재료 표 참조)를 취하고 모든 웰에 100μL의 성장 배양 배지를 채웁니다. 우물 사이의 공간을 DPBS로 채 웁니다.참고: 이는 96웰 플레이트에서 세포를 배양할 때 관찰되는 증발로 인한 가장자리 효과를 줄이기 위해 수행됩니다. 플레이트를 5%CO2가 있는 인큐베이터에서 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 3. 세포의 파종 섹션 1에 설명된 대로 배양 플라스크에서 세포를 분리하고 50mL 튜브의 신선한 성장 배지에 재현탁합니다. 선택한 방법을 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산하십시오.참고: A549 세포의 경우 생존율은 일반적으로 ~100%에 이릅니다. 세포 수를 결정하기 위해 아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드화물 염색을 기반으로 하는 자동 세포 분석 시스템을 사용합니다( 재료 표 참조). 다른 세포 계수 방법도 똑같이 잘 작동합니다. 원하는 세포 밀도를 얻기 위해 신선한 성장 배지에서 세포를 재현탁합니다. 이 연구에서 최적의 A549 세포 밀도는 0.15 × 106 (생존) 세포/mL입니다. 인큐베이터에서 interdigitated 전극이있는 96 웰 플레이트를 꺼내고 다중 채널 피펫으로 배지를 제거합니다. 96-웰 플레이트에 웰 당 100 μL의 세포 현탁액(이 경우 15 ×10 3 세포에 해당)을 분주한다. 세포를 CEI 장치에 넣기 전에 실온에서 15분 동안 평형을 이루도록 합니다. 4. CEI 분석 설정 및 실행 CEI 장치 플레이트 홀더가 있는 인큐베이터를 37°C 및 5%CO2에 놓습니다. 장치에 96웰 플레이트를 놓습니다. 기기의 소프트웨어를 열고 데이터 수집 패널에서 설정을 클릭하여 새 실험을 설정합니다. 랩톱이 ECIS 장치에 연결될 때까지 기다렸다가 웰의 임피던스를 확인하여 플레이트를 구성합니다. 녹색으로 표시된 대로 모든 웰이 올바르게 구성되었는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 모든 웰이 녹색이 될 때까지 4.2단계를 반복합니다. Well Configuration 창에서 사용된 Culture Ware에 따라 배열 유형을 선택합니다. 다중 주파수/시간 모드를 선택합니다.알림: 이 모드에서 장치는 주파수 범위에서 임피던스 변화를 측정합니다. 시작을 클릭하여 측정을 시작합니다.알림: 실시간 임피던스는 소프트웨어 인터페이스에서 모니터링할 수 있습니다. 표시할 주파수 를 선택합니다. 이 예에서는 16kHz가 선택됩니다. 5. 화합물 준비 및 배양 참고: 항바이러스 화합물의 예로 labyrinthopeptin A1이 사용됩니다( 재료 표 참조). 이 프로토콜은 잠재적인 항바이러스 활성이 있는 모든 화합물에 일반화될 수 있기 때문에 이를 ‘화합물’이라고 합니다. 소 태아 혈청(FBS)(‘분석 완충액’이라고 함)을 첨가하지 않은 완전한 세포 배양 배지가 RT에서 평형을 이루도록 합니다. 화합물을 얼음 위에 보관하십시오. 5mL 폴리프로필렌 튜브의 분석 배지에서 각 화합물의 10배 농축 희석액을 준비합니다. 5mL 폴리프로필렌 튜브의 분석 배지에서 화합물을 연속적으로 희석하여 원하는 10x 농도를 얻습니다. 데이터 수집 설정 분할창에서 일시정지를 클릭하여 CEI 장치를 일시정지하십시오. 현재 시점이 완료될 때까지 기다렸다가 96웰 플레이트를 꺼냅니다. 광학 현미경으로 세포의 부착 및 단층 형성을 확인합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 20 μL를 제거합니다. 20 μL의 화합물 용액 또는 비히클을 원하는 웰에 첨가한다. 적절한 피펫팅을 위한 특정 조건으로 레이아웃을 준비하십시오. 플레이트를 5%CO2와 함께 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.참고: 이 배양 단계에는 CEI 장치 대신 일반 세포 배양기가 사용됩니다. 세포 대조군 (CC) 웰은 비히클-처리된 웰이다. 6. 바이러스 준비 및 감염 바이러스 스톡이 담긴 바이알을 해동합니다. 이 예에서는 ZIKV MR766 및 ZIKV PRVABC59가 사용됩니다. 원하는 MOI에서 바이러스 희석액 또는 15mL 폴리프로필렌 튜브의 분석 배지에서 희석액을 준비합니다.참고: 이 대표적인 예에서는 MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 및 0.00005가 사용됩니다. 100 μL의 바이러스 희석액을 96 웰 플레이트의 지정된 웰에 추가합니다. 분석 배지를 CC 웰에 추가합니다. 사용된 바이러스 용기의 오염을 제거합니다. 플레이트를 CEI 장치에 다시 넣고 실험 재개를 클릭하여 연속 6일 동안 측정을 계속합니다.참고: 바이러스 대조군(VC) 웰은 비히클 처리된 감염된 세포인 반면, CC 웰에서는 바이러스 희석 대신 분석 배지가 추가됩니다. 화합물의 세포 독성이 평가되는 경우 바이러스 희석 대신 100μL의 분석 버퍼를 추가합니다. 7. 데이터 분석 마침을 클릭하여 실험을 종료하고 나타나는 창에 특정 실험 조건에 대한 정보와 같은 선택적 요약 설명을 추가합니다. 데이터 수집이 완료되면 확인을 클릭합니다. 실험이 끝날 때 CC와 VC 간의 가장 큰 임피던스 차이가 측정되는 그래프 창에서 원하는 주파수를 선택합니다.최적의 주파수를 결정하려면 감염되지 않은 세포와 감염된 세포에 대한 파일럿 실험을 실행하고 감염된 세포의 임피던스가 기준선 수준으로 떨어진 시점에서 감염되지 않은 세포와 감염된 세포 간에 관찰된 임피던스 차이가 가장 큰 빈도를 선택합니다. ZIKV에 감염된 A549 세포의 경우 16kHz입니다. 모든 데이터를 스프레드시트 형식으로 내보내려면 웰 구성 분할창에서 모든 웰 이 선택되어 있는지 확인하고 파일 | 데이터 내보내기 | 그래프 데이터. 모든 데이터 포인트에서 실험 종료 시 측정된 평균 VC 임피던스 값을 빼고 이를 감염 전에 측정된 마지막 시점의 평균 CC 임피던스 값으로 나누어 데이터를 정규화합니다. 정규화된 데이터를 시간 함수로 플로팅하여 CEI 프로파일 그래프를 얻습니다. 각 조건의 정규화된 곡선 아래 면적(AUCn)을 계산하여 50% 억제 농도(IC50)와 같은 파라미터를 결정합니다. 예를 들어 다양한 바이러스 균주의 감염성을 비교하기 위해 CIT50과 같은 다른 유용한 매개 변수를 계산합니다.