Summary

Nanodisk İçeren Biyoaktif Ajanın Formülasyonu ve Karakterizasyonu

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

Burada, nanodiskler içeren biyoaktif ajanların üretimini ve karakterizasyonunu açıklıyoruz. Amfoterisin B nanodiskleri, protokolü aşamalı olarak tanımlamak için örnek olarak alınmıştır.

Abstract

Nanodisk terimi, çift katmanlı bir lipit, bir iskele proteini ve entegre bir biyoaktif ajandan oluşan ayrı bir nanopartikül tipini ifade eder. Nanodiskler, çevresi genellikle değiştirilebilir apolipoprotein ailesinin bir üyesi olan iskele proteini tarafından çevrelenen disk şeklinde bir lipit çift katmanı olarak düzenlenir. Çok sayıda hidrofobik biyoaktif ajan, parçacığın lipit çift katmanının hidrofobik ortamına entegrasyonlarıyla nanodisklerde verimli bir şekilde çözünür ve çapı 10-20 nm aralığında büyük ölçüde homojen bir parçacık popülasyonu elde edilir. Nanodisklerin formülasyonu, bireysel bileşenlerin kesin bir oranını, her bir bileşenin uygun bir sıralı ilavesini ve ardından formülasyon karışımının banyo sonikasyonunu gerektirir. Amfipatik iskele proteini, ayrık, homojen bir nanodisk parçacıkları popülasyonu oluşturmak için lipit / biyoaktif ajan karışımı oluşturan dağınık çift katmanlı ile kendiliğinden temas eder ve yeniden düzenler. Bu proses sırasında, reaksiyon karışımı opak, bulanık bir görünümden, tamamen optimize edildiğinde santrifüjleme sırasında çökelti vermeyen berraklaştırılmış bir numuneye geçer. Karakterizasyon çalışmaları, biyoaktif madde çözünürlük verimliliği, elektron mikroskobu, jel filtrasyon kromatografisi, ultraviyole görünür (UV / Vis) absorbans spektroskopisi ve / veya floresan spektroskopisinin belirlenmesini içerir. Bunu normalde kültürlenmiş hücreler veya fareler kullanılarak biyolojik aktivitenin araştırılması izler. Bir antibiyotik barındıran nanodiskler (yani, makrolid polien antibiyotik amfoterisin B) durumunda, maya veya mantarların büyümesini konsantrasyon veya zamanın bir fonksiyonu olarak inhibe etme yetenekleri ölçülebilir. Formülasyonun göreceli kolaylığı, bileşen parçalarına göre çok yönlülük, nano ölçekli parçacık boyutu, doğal stabilite ve sulu çözünürlük, nanodisk teknolojisinin sayısız in vitro ve in vivo uygulamasına izin verir. Bu makalede, hidrofobik biyoaktif ajan olarak amfoterisin B içeren nanodiskleri formüle etmek ve karakterize etmek için genel bir metodoloji açıklanmaktadır.

Introduction

Yeni ortaya çıkan diskoidal yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL’ler), insan dolaşım sisteminde bulunan çok daha bol küresel HDL’nin doğal olarak oluşan progenitörleridir. Pre-ß HDL olarak da adlandırılan bu yeni ortaya çıkan parçacıklar, benzersiz ve ayırt edici yapısal özelliklere sahiptir1. Aslında, küresel bir parçacık olarak var olmak yerine, yeni ortaya çıkan HDL’ler disk şeklindedir. Doğal ve yeniden yapılandırılmış diskoidal HDL’ler üzerine yapılan kapsamlı yapısal karakterizasyon çalışmaları, çevresi apoA-I gibi bir amfipatik değiştirilebilir apolipoprotein (apo) ile çevrelenmiş bir fosfolipid çift katmandan oluştuğunu ortaya koymuştur. İnsan lipoprotein metabolizmasında, dolaşımdaki yeni ortaya çıkan HDL’ler, periferik hücrelerden lipitler tahakkuk ettirir ve ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı A1 ve lesitin: kolesterol asiltransferse2 dahil olmak üzere anahtar protein aracılarına bağlı bir süreçte küresel HDL’lere olgunlaşır. Bu süreç, kalp hastalığına karşı koruyucu olduğu düşünülen ters kolesterol taşıma yolunun kritik bir bileşenini temsil eder. Bu bilgi ve diskoidal HDL’leri yeniden oluşturma yeteneği ile donanmış olan araştırmacılar, bu parçacıkları aterosklerozu tedavi etmek için terapötik bir müdahale olarak kullandılar3. Temel olarak, yeniden yapılandırılmış HDL’nin (rHDL) hastalara infüzyonu, plak birikintilerinden kolesterol efflüksünü teşvik eder ve safra asitlerine dönüşüm ve vücuttan atılım için karaciğere geri döndürür. Birçok biyoteknoloji/ilaç şirketi bu tedavi stratejisini izlemektedir4.

Aynı zamanda, bu parçacıkları laboratuvarda üretme yeteneği, yeni uygulamalara ve yeni teknolojilere yol açan bir araştırma faaliyetleri telaşını tetiklemiştir. Öne çıkan bir uygulama, rHDL parçacıklarının, transmembran proteinlerini doğal benzeri bir ortamda barındırmak için minyatür bir membran olarak kullanılmasını içerir5. Bugüne kadar, yüzlerce protein diskoidal rHDL’ye başarıyla dahil edilmiştir ve araştırmalar, bu proteinlerin reseptörler, enzimler, taşıyıcılar vb. Olarak hem doğal konformasyonu hem de biyolojik aktiviteyi koruduğunu göstermiştir. “Nanodiskler” olarak adlandırılan bu parçacıkların, genellikle yüksek çözünürlükte6’da yapısal karakterizasyona uygun olduğu gösterilmiştir. Transmembran proteinlerinin araştırılmasına yönelik bu yaklaşım, deterjan miselleri veya lipozomlarla yapılan çalışmalardan daha üstün olarak kabul edilmektedir ve sonuç olarak hızla ilerlemektedir. Bir rHDL oluşturabilen iki farklı yöntemin bildirildiğini bilmek önemlidir. “Kolat diyalizi” yöntemi13 , transmembran proteinlerinin rHDL çift katmanlı5’e dahil edilmesiyle ilgili uygulamalar için popülerdir. Temel olarak, bu formülasyon yöntemi, fosfolipit oluşturan bir çift katmanlı, bir iskele proteini ve ilgilenilen transmembran proteininin, deterjan sodyum kolatı (veya sodyum deoksikolat; misel moleküler ağırlığı [MW] 4.200 Da) içeren bir tamponda karıştırılmasını içerir. Deterjan, farklı reaksiyon bileşenlerini etkili bir şekilde çözündürür ve numunenin deterjan içermeyen tamponlara karşı diyalize edilmesine izin verir. Diyaliz adımı sırasında, deterjan numuneden çıkarılırken, kendiliğinden bir rHDL oluşur. Bu yaklaşım, ilgilenilen bir transmembran proteinini yakalamak için kullanıldığında, ürün parçacıkları nanodiskler5 olarak adlandırılmıştır. Bununla birlikte, küçük moleküllü hidrofobik biyoaktif ajanları (MW <1.000 Da) dahil etmek için bu yöntemi kullanma girişimleri büyük ölçüde başarısız olmuştur. Transmembran proteinlerinin aksine, küçük moleküllü biyoaktif ajanlar, deterjanla birlikte diyaliz torbasından kaçabilir, bu da rHDL'lere dahil edilme verimliliklerini büyük ölçüde azaltır. Bu sorun, deterjanların formülasyon karışımı14’ten çıkarılmasıyla çözüldü. Bunun yerine, bileşenler sulu bir tampona sırayla eklenir, lipit oluşturan çift katmandan başlayarak, nanodisk olarak adlandırılan rHDL içeren kararlı bir biyoaktif ajan oluşturur. Diğerleri, in vivo görüntüleme ajanlarının dahil edilmesi ve taşınması için rHDL’yi kullanmıştır7. Daha yakın zamanlarda, ligand bağlama çalışmalarında bir apolipoprotein iskelesi ve anyonik gliserofosfolipid, kardiyolipinden oluşan özel rHDL kullanılmıştır. Bu parçacıklar, kardiyolipinin kalsiyum, sitokrom c ve antikanser ajanı doksorubisin8 dahil olmak üzere suda çözünür çeşitli ligandlarla etkileşiminin incelenmesi için bir platform sağlar.

Bu çalışmanın odak noktası, istikrarlı bir şekilde dahil edilmiş hidrofobik biyoaktif ajana (yani nanodisk) sahip olan rHDL’nin formülasyonu üzerinedir. Bu ajanların diskoidal rHDL partiküllerinin lipit ortamına entegre olma yeteneği, onlara etkili bir şekilde sulu çözünürlük kazandırır. Bu nedenle, nanodiskler in vivo terapötik uygulamalar için potansiyele sahiptir. Nanodiskleri formüle ederken, ayrık hidrofobik biyoaktif ajanları ürün parçacığına başarılı bir şekilde dahil etmek için spesifik inkübasyon / reaksiyon koşulları gereklidir ve bu raporun amacı, belirli uygulamalar için yeni nanodisk parçacıkları oluşturmak için temel bir şablon olarak kullanılabilecek ayrıntılı pratik bilgiler sağlamaktır. Bu nedenle, bu makale bağlamında, nanodisk ve nanodisk terimleri birbirinin yerine kullanılamaz. Nanodisk, lipit çift katmanlı5’e gömülü bir transmembran proteini içerecek şekilde formüle edilmiş bir rHDL’yi ifade ederken, nanodisk terimi, amfoterisin B14 gibi düşük moleküler ağırlıklı (< 1.000 Da) hidrofobik biyoaktif ajanları içerecek şekilde formüle edilmiş bir rHDL'yi ifade eder.

Uygun iskele proteinlerinin elde edilmesi için çeşitli yöntemler mevcuttur. İskele proteinlerini üreticilerden [örneğin apoA-I (SRP4693) veya apoE4 (A3234)] satın almak mümkündür, ancak maliyet sınırlayıcı bir faktör olabilir. Tercih edilen bir yaklaşım, Escherichia coli’deki rekombinant iskele proteinlerini eksprese etmektir. İnsan apoA-I9, apoE410 ve böcek hemolenf proteini apolipophorin-III11 için protokoller yayınlanmıştır. Burada açıklanan deneylerin amacı doğrultusunda, rekombinant insan apoE4 N-terminal (NT) alanı (amino asitler 1-183) kullanılmıştır. İnsan apoE4-NT’yi kodlayan nükleotid dizisi sentezlendi ve vektör kodlu pelB lider dizisine doğrudan bitişik bir pET-22b (+) ekspresyon vektörüne yerleştirildi. Bu yapı bir pelB lider dizisi-apoE4-NT füzyon proteininin ekspresyonuna yol açar. Protein sentezini takiben, bakteriyel pelB lider dizisi, yeni sentezlenen proteini, lider peptidazın pelB dizisini parçaladığı periplazmik boşluğa yönlendirir. Ortaya çıkan apoE4-NT proteini, hiçbir dizi etiketi veya kuyruğu olmadan, daha sonra bakterilerden kaçar ve11,12 kültür ortamında birikerek aşağı akış işlemeyi basitleştirir.

Protocol

1. İskele protein bileşeninin dönüşümü, ekspresyonu ve saflaştırılması Plazmid içeren apoE4-NT ile BL21 bakteriyel transformasyonuBL21 (DE3) yetkin hücrelerden oluşan bir tüpü buz üzerinde 10 dakika boyunca çözün. Tüm buzlar eridikten sonra, 50 μL hücreyi buz üzerindeki bir dönüşüm tüpüne nazikçe ve dikkatlice karıştırın. Hücre karışımına 50 ng plazmid DNA’sı içeren 5 μL ekleyin (dizi için Ek Tablo 1’e ba…

Representative Results

Biyoaktif ajan nanodisk formülasyon prosesiTarif edilen ampB-nanodisk formülasyon prosedüründe, numune görünümü bulanıktan berraklığa geçtiğinde reaksiyon tamamlanmış sayılır (Şekil 1). Bu değişiklik, nanodisklerin oluştuğunu ve biyoaktif maddenin çözünür hale geldiğini gösterir. Çoğu zaman, biyoaktif ajanlar görünür dalga boyu bölgesindeki ışığı emer (örneğin, ampB, kurkumin, lutein, koenzim Q10) ve bu durumlarda numun…

Discussion

Nanodiskler içeren bir biyoaktif maddenin formülasyonu, aksi takdirde çözünmeyen hidrofobik bileşikleri çözmek için uygun bir yöntem sağlar. Ürün biyoaktif ajan nanodiskleri sulu ortamda tamamen çözünür olduğundan, çok çeşitli hidrofobik moleküller için yararlı bir dağıtım yöntemi sağlarlar (Tablo 1). Bunlar arasında küçük moleküller, doğal ve sentetik ilaçlar, bitkisel besinler, hormonlar vb. Bulunur. Formülasyon stratejisi genellikle biyoaktif maddenin organik çöz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (R37 HL-64159) bir hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Amphotericin B Cayman Chemical Company 11636 ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin Fisher Scientific BP17925 Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid GenScript N/A Transformation
Baffled Flask New Brunswick Scientific N/A Expansion & Expression
BL21 competent E coli New England Biolabs C2527I Transformation
Centrifuge bottles Nalgene 3140-0250 Expression
Chloroform Fisher Scientific G607-4 ND Formulation
DMSO Sigma Aldrich 472301 Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine Avanti Lipids 850345P ND Formulation
Erlenmeyer flask Bellco Biotechnology N/A Expansion & Expression
Falcon Tubes Sarstedt Ag & Co D51588 Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes VWR 47729-570 ND Formulation
GraphPad (Software) Dotmatics N/A Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath VWR N/A ND Formulaton
Heating and Nitrogen module Thermo Scientific TS-18822 ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL) GE Healthcare 17-0407-03 Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside  Fisher Scientific BP1755 Expression
J-25 Centrifuge Beckman Coulter J325-IM-2 Expression
JA-14 Rotor Beckman Coulter 339247 Expression
Lyophilizer Labconco 7755030 ND Formulation
Methanol Fisher Scientific A452-4 ND Formulation
Nitrogen gas Praxair UN1066 ND Formulation
NZCYM media RPI Research Products N7200-1000.0 Expansion & Expression
Pet-22B vector GenScript N/A Transformation
Petri dish Fisher Scientific FB0875718 Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes Fisher Brand 14385 928A Spectral Analysis
Shaking Incubator New Brunswick Scientific M1344-0004 Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys Thermo Scientific 66430 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 68100 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 88243 Purification
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Purification
Sodium Phosphate dibasic Fisher Scientific S374-500 Purification
Sodium Phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500 Purification
Spectra/POR Weighted Closures Spectrum Medical Industries 132736 Purification
Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 220-92961-01 spectral analysis
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 366816 ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software) Shimadzu N/A Spectral Analysis
Vacuum filter Millipore 9004-70-0 Expression & Purification
Vacuum pump GAST Manufacturing Inc DOA-P704-AA Expression & Purification
Vortex Fisher Scientific 12-812 ND Formulation
Yeast N/A BY4741 Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose BD 242820 Yeast Viability Assay

References

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704 (2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065 (2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).

Play Video

Cite This Article
Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I., Swackhamer, M., Karo, M., Lockhart, R., Ryan, R. O. Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks. J. Vis. Exp. (193), e65145, doi:10.3791/65145 (2023).

View Video