В данной работе мы представляем протокол отбора in vitro инженерных транскрипционных репрессоров (ETR) с высокой, долгосрочной, стабильной, целевой эффективностью подавления и низкой общегеномной внецелевой активностью. Этот рабочий процесс позволяет свести первоначальный сложный репертуар кандидатов ETR к короткому списку, пригодному для дальнейшей оценки в терапевтически значимых условиях.
Инактивация генов играет важную роль в изучении функции генов и представляет собой перспективную стратегию лечения широкого спектра заболеваний. Среди традиционных технологий РНК-интерференция страдает от частичной отмены мишени и требует пожизненного лечения. В отличие от них, искусственные нуклеазы могут обеспечить стабильную инактивацию генов через индукцию двухцепочечного разрыва ДНК (DSB), но недавние исследования ставят под сомнение безопасность этого подхода. Целенаправленное эпигенетическое редактирование с помощью инженерных транскрипционных репрессоров (ETR) может представлять собой решение, поскольку однократное введение определенных комбинаций ETR может привести к длительному подавлению без индуцирования разрывов ДНК.
ETR — это белки, содержащие программируемый ДНК-связывающий домен (DBD) и эффекторы из встречающихся в природе транскрипционных репрессоров. В частности, было показано, что комбинация из трех ETR, оснащенных доменом KRAB человеческого ZNF10, каталитическим доменом DNMT3A человека и DNMT3L человека, индуцирует наследуемые репрессивные эпигенетические состояния на гене-мишени ETR. Характер этой платформы, отсутствие влияния на последовательность ДНК мишени и возможность возврата к репрессивному состоянию путем деметилирования ДНК по требованию делают эпигенетическое молчание инструментом, меняющим правила игры. Критическим этапом является определение правильного положения ETR на гене-мишени для максимизации целевого и минимизации нецелевого молчания. Выполнение этого этапа в доклинических условиях ex vivo или in vivo может быть обременительным.
Взяв CRISPR/каталитически мертвую систему Cas9 в качестве парадигматического DBD для ETR, в этой статье описывается протокол, состоящий из скрининга in vitro направляющих РНК (гРНК) в сочетании с комбинацией triple-ETR для эффективного подавления на мишени с последующей оценкой полногеномного профиля специфичности топ-хитов. Это позволяет свести первоначальный репертуар гРНК-кандидатов к короткому списку перспективных, сложность которых подходит для их окончательной оценки в интересующих терапевтически значимых условиях.
Инактивация генов традиционно играла ключевую роль в изучении функции генов как в клеточных, так и в животных моделях. Кроме того, в последние два десятилетия, с развитием генной терапии, она была предложена в качестве потенциально революционного подхода к лечению заболеваний, вызванных мутациями усиления функции1, инфекционными заболеваниями2 или патологиями, при которых подавление одного гена может компенсировать наследственный дефект вдругом. Наконец, была предложена генетическая инактивация ключевых регуляторов клеточной приспособленности и функционального контроля для повышения эффективности клеточных продуктов для иммунотерапии рака4 и регенеративной медицины5.
Среди различных технологий инактивации генов одной из наиболее перспективных является таргетная эпигенетическая подавление 6,7. В основе этой технологии лежат так называемые инженерные транскрипционные репрессоры (ETR), химерные белки, состоящие из программируемого ДНК-связывающего домена (DBD) и эффекторного домена (ED) с эпигенетической репрессивной функцией. Белки цинковых пальцев (ZFPs)8, эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALEs)9 или DBD на основе CRISPR/dCas910 могут быть разработаны для селективного связывания ЭД с последовательностью промотора/энхансера гена-мишени, который необходимо замолчать. Оказавшись там, ЭД ETR выполняет свою активность по подавлению, накладывая гетерохроматин-индуцирующие репрессивные эпигенетические метки, такие как модификации гистонов (метилирование H3K9 11,12 или H3K27 13, деацетилированиеH3 или H414) и метилирование ДНКCpG 15, в зависимости от используемого репрессивного домена.
В частности, под влиянием молекулярных процессов перманентной транскрипционной репрессии эндогенных ретровирусов, происходящих в преимплантационном эмбрионе16, была создана комбинация из трех ETR для использования следующих ЭД: i) Krüppel-ассоциированный бокс-домен (KRAB) человеческого ZNF10; ii) каталитический домен человеческой de novo ДНК-метилтрансферазы 3A (DNMT3A); и iii) полноразмерная ДНК-метилтрансфераза 3-типа человека (DNMT3L). KRAB представляет собой консервативный репрессивный домен, общий для нескольких ZFP у высших позвоночных17,18, чья активность сайленсинга в основном основана на его способности рекрутировать KAP1 19-белок-каркас, который затем взаимодействует с несколькими другими индукторами гетерохроматина 20, включающими комплекс ремоделирования и деацетилирования нуклеосом (NuRD) 21, H3K9-гистон-метилтрансферазу SETDB122 и считыватель метилирования H3K9 HP1 23, 24, среди прочих.
DNMT3A активно переносит метильные группы на ДНК в последовательностях CpG25. Каталитическая активность DNMT3A усиливается его физической ассоциацией с DNMT3L, ограниченным эмбрионами и половыми клетками паралогом DNMT3A, в котором отсутствует каталитический домен, ответственный за перенос метильной группы26,27. Метилирование ДНК в богатых CpG областях, называемых островками CpG (CGI), встроенных в промоторные/энхансерные элементы генов млекопитающих, обычно связано с подавлением транскрипции28. Важно отметить, что после депонирования метилирование CpG может стабильно наследоваться на протяжении всего митоза молекулярным комплексом на основе UHRF1-DNMT129.
Стабильная гиперэкспрессия ETR в клетке-мишени может быть проблематичной, вероятно, из-за растущего риска нецелевой активности и подавления эндогенных интеракторов из их физиологических целевых участков с течением времени. Тем не менее, транзиторная экспрессия одиночных фрагментов ETR может не вызывать длительного подавления с высокойэффективностью 30, что затрудняет их терапевтическое применение. Таким образом, основополагающим прорывом в этой области стало доказательство того, что комбинация трех ETR на основе KRAB, DNMT3A и DNMT3L может синергизировать и, даже при временной совместной доставке, накладывать на промоторную последовательность гена-мишени H3K9 и метилирование CpG. Затем они считываются и размножаются клеткой на протяжении всего митоза, что приводит к наследуемому молчанию в нескольких клеточных линиях человека и мышей, а также в первичныхклетках ex vivo.
Следует отметить, что эпигенетическое подавление, налагаемое ETR, может быть обращено вспять по требованию путем целенаправленного (например, рекрутирование ДНК-деметилазы TET1 на основе CRISPR/dCas9 на заглушенный локус) или фармакологического (введение ингибитора ДНК-метилтрансферазы 5-Aza) деметилированияДНК 30, потенциального антидота в случае нежелательных явлений, связанных с ETR. Также были описаны универсальные ETR, содержащие три ЭД на основе KRAB, DNMT3A и DNMT3L, демонстрирующие значительную эффективность подавления в клеточных линиях31,32 против подавляющего большинства генов, кодирующих белки. Кроме того, в нескольких исследованиях с использованием ETR сообщалось о высоком профиле безопасности, без значительной нецелевой активности с точки зрения de novo метилирования CpG или изменения доступности хроматина30,31,32. Тем не менее, перед клиническим применением рекомендуется провести специальный анализ профиля специфичности ETR, оснащенных недавно разработанным DBD.
С клинической точки зрения, таргетное эпигенетическое подавление может обеспечить критические преимущества как для нокдауна33 на основе РНК-интерференции (РНК-интерференции), так и для искусственного разрушения генов на основе нуклеазы8. В отличие от РНК-интерференции, таргетное эпигенетическое молчание может индуцировать полную отмену своей мишени для каждой клетки и не требует периодического лечения для обеспечения долгосрочного молчания; В отличие от разрушения генов, он оставляет последовательность ДНК неизменной, избегая образования двухцепочечных разрывов ДНК (DSB). Затем DSB могут индуцировать апоптоз и остановку клеточного цикла, потенциально приводя к отбору против клеток с функциональным путем p5334,35 и, особенно в условиях мультиплексного редактирования генов, хромосомными перестройками 35. Кроме того, ретранслируя необратимый мозаичный результат не гомологичной репарации DSB ДНК36, опосредованной концевым соединением, разрушение гена не может избежать внутрикадровой репарации мишени в функциональные кодирующие последовательности в качестве одного из конечных результатов и, в отличие от эпигенетического молчания, не может быть стерто по требованию.
Наконец, эпигенетическое молчание обладает потенциалом для расширения диапазона целевых генетических элементов до классов, полностью или, по крайней мере, частично рефрактерных к РНК-интерференции и разрушению генов, таких как нетранскрибируемые регуляторные элементы и некодирующие РНК30,32. Первым критическим шагом для любого целевого приложения эпигенетического подавления является разработка панели ETR, охватывающей различные регуляторные последовательности гена-мишени, и определение наиболее эффективных из них. Количество ETR, подлежащих тестированию, может иметь решающее значение, учитывая растущую часть генома, которая может быть нацелена программируемыми технологиями связывания ДНК, которыепостоянно разрабатываются. Выполнение скрининга ETR непосредственно на типе клеток, в котором терапевтическое подавление гена-мишени является наиболее подходящим вариантом. Тем не менее, высокопроизводительные экраны могут быть технически громоздкими в первичных клетках из-за их ограниченной выживаемости в культуре и их часто неоптимальной инженерной способности. Крупномасштабные экраны могут быть еще более неосуществимыми in vivo.
Более практичная альтернатива состоит в том, чтобы сначала провести первоначальный скрининг большой панели ETR в легко конструируемых клеточных линиях, а затем валидировать только наиболее перспективные из них в терапевтически значимом типе клеток. Параллельной проблемой является выбор соответствующего показания для измерения эффективности глушения ETR. Непосредственная оценка уровня транскрипта или белка гена-мишени с помощью ОТ-кПЦР, вестерн-блоттинга или ИФА может быть дорогостоящей и трудоемкой, а также может не иметь достаточной чувствительности, что ограничивает их применение в высокопроизводительных масштабах. Генерация специально спроектированных репортерных клеточных линий, в которых флуорофор находится под транскрипционным контролем регуляторных последовательностей гена-мишени, позволяет использовать подход, основанный на проточной цитометрии, для считывания эпигенетического сайленсинга на уровне одной клетки и с высокой пропускной способностью.
Следуя этим общим соображениям, в данной статье описывается протокол, состоящий из массивного скрининга ETR in vitro для повышения эффективности подавления на мишени с последующей оценкой полногеномной внецелевой активности топ-хитов. Этот рабочий процесс позволяет сократить первоначальный репертуар ETR-кандидатов до короткого списка перспективных, сложность которых подходит для их окончательной оценки в интересующем терапевтически значимом типе клеток.
Среди различных программируемых DBD, которые могут быть использованы для генерации ETR, этот протокол будет сосредоточен на технологии на основе CRISPR/dCas9 из-за простоты разработки гРНК, охватывающих промотор гена-мишени в масштабе высокой пропускной способности. Тем не менее, тот же концептуальный рабочий процесс, описанный ниже, может быть использован для оценки эффективности и специфичности ETR, оснащенных другими DBD.
Целенаправленное эпигенетическое подавление может представлять собой многообещающее решение для лечения заболеваний, которые могут выиграть от постоянной инактивации генов, включая заболевания, вызванные мутациями усиления функции1, инфекционные заболевания2 и патологии, при которых подавление одного гена может либо компенсировать наследственный дефект в другом гене3, либо раскрыть весь потенциал адоптивной клеточной терапии4. 5. См. Действуя на уровне хроматина и автоматически размножаясь клеткой 7,30,32, эпигенетическое подавление может избежать токсических изменений (например, хромосомных перестроек) последовательности ДНК гена-мишени и частичного, преходящего молчания мишени, которые являются ограничениями искусственного разрушения генов на основе нуклеаз 8,34,35 и нокдауна 33 на основе РНК-интерференции соответственно.
Одним из ключевых предварительных шагов в любом протоколе эпигенетического молчания является определение правильного положения на гене-мишени для направления ETR, которые будут депонировать репрессивные эпигенетические метки, необходимые для выключения транскрипционной активности мишени. Различные проксимальные и дистальные регуляторные элементы стартового сайта транскрипции могут совпадать для поддержки транскрипционного выхода данного человеческого гена54. Кроме того, благодаря растущему числу программируемых технологий связывания ДНК теперь можно идентифицировать различные целевые сайты для каждого конкретного регуляторного элемента6. Таким образом, протоколы, подобные описанному здесь в разделе «Сконструированные клеточные линии», могут быть использованы для номинирования отдельных целевых участков и/или областей генома, поддающихся эпигенетическому подавлению, опосредованному ETR, прежде чем приступать к громоздким и трудоемким усилиям по оценке лучших кандидатов в окончательной терапевтической обстановке. Ниже описаны некоторые критические аспекты протокола.
Инженерия репортерной клеточной линии, предикторующая конечную терапевтическую мишень
Несмотря на постоянную оптимизацию протоколов клеточной инженерии, необходимых для вставки кассетного кодирования флуоресцентного репортера в ген-мишень и доставки ETR, нельзя считать само собой разумеющимся, что они уже могут быть доступны для клеточной линии, которая больше всего похожа на конечную терапевтическую мишень. В этом случае могут быть применены различные стратегии смягчения последствий: а) использование наборов оптимизации, предоставляемых поставщиками, для внутренней оптимизации протокола трансфекции для целевой клеточной линии; б) переключение на другие клеточные линии, все еще экспрессирующие этот ген-мишень, но принадлежащие тканям, отличным от конечной терапевтической мишени, для которых инженерные протоколы были тщательно оптимизированы. В случае, если эти варианты недоступны, можно рассмотреть возможность переключения на первичные типы клеток или органоиды, представляющие конечную мишень. Как правило, как для доклинических исследований, так и для терапевтического применения эпигенетического подавления на основе ETR, сценарии, в которых ген-мишень важен для целевого типа клеток, должны быть отброшены. Полное, долгосрочное подавление важного гена, навязанное ETR, со временем приведет к контротбору клеток-мишеней (и, возможно, к токсичности лечения). В этих случаях предпочтение отдается альтернативным технологиям, обеспечивающим частичную отмену мишени, таким как РНК-интерференция33.
Оценка активности ETR по подавлению сигналов на цели
ETR, основанные на комбинации эффекторных доменов KRAB, DNMT3A и DNMT3L, доказали свою эффективность в отношении подавляющего большинства генов, кодирующих белки, с широким окном долгосрочного разрешающего таргетирования около 1 килобазы, сосредоточенным на начальном сайте транскрипции32. Чтобы получить представление о том, как выглядит хорошо проведенный эксперимент по эпигенетическому подавлению, здесь представлены технические детали и результаты подавления гена B2M в клетках K-562. Это можно считать важным положительным контролем, который должен быть включен не только исследователями, работающими с клетками К-562, но и теми, кто впервые приближается к технологии на основе ETR. Как указано в протоколе, искусственное разрушение генов на основе нуклеазы (например, CRISPR/Cas9) рекомендуется в качестве дополнительного контроля как эффективности доставки генов в интересующем типе клеток, так и фенотипа клеток, лишенных гена-мишени. После первоначального скрининга гРНК, которые должны быть соединены с ЭТР на основе CRISPR/dCas9, если ни одна из тестируемых гРНК не способна навсегда заставить замолчать ген-мишень, следует рассмотреть вопрос в следующем порядке: 1) увеличение количества доставляемых гРНК и ЭТР; 2) тестирование пулов топовых гРНК на предмет синергетических эффектов между ними. Если долгосрочное подавление по-прежнему не достигается, следует рассмотреть: 3) тестирование дополнительных гРНК, которые могут быть нацелены на сайты, более релевантные для инструктажа эпигенетического молчания; 4) переход на DBD-платформы на базе ZFP8 или TALE9, которые могут иметь улучшенную связывающую способность с целевым хроматином; 5) переход от переходного к стабильному — например, интеграция вирусной векторной экспрессии ETR (либо гРНК, либо конструкции слияния dCas9, либо и то, и другое при внедрении технологии CRISPR/dCas9). Поскольку наша группа разработала и имеет большой опыт совместной доставки трех отдельных ETR30, протокол и результаты, показанные здесь, основаны на этом подходе. Тем не менее, аналогичный концептуальный рабочий процесс, вероятно, может быть применен и к системе «все в одном» на основе CRISPR32.
Оценка нецелевой деятельности ЕТР
Многочисленные исследования показали предварительные признаки in vitro специфичности ETR, основанные на комбинации эффекторных доменов KRAB, DNMT3A и DNMT3L30,31,32. Однако, если среди исследованных гРНК ни одна из них не демонстрирует удовлетворительного профиля специфичности с точки зрения транскрипционной регуляции и/или метилирования ДНК de novo, можно использовать две невзаимоисключающие стратегии: а) сокращение времени пребывания ЭТР внутри клетки (и, следовательно, их потенциальной внецелевой активности) либо путем снижения доз ЭТР, либо путем тестирования альтернативных систем доставки. Например, по сравнению с плазмидами, ожидается, что доставка мРНК и белка сократит время воздействия на клетки ETR и, следовательно, вероятность нецелевой активности55; б) переход на более поздние варианты Cas9, оптимизированные для уменьшения нецелевого связывания платформы56, или на альтернативные технологии связывания ДНК на основе ZFP8 или TALE9. Важно учитывать, что, по сравнению с образцами, обработанными имитационной обработкой, на целевую и нецелевую активность подавления экспрессии генов влияет не только связывание DBD с их целевой последовательностью, но и потенциальная способность эпигенетических эффекторных доменов рекрутироваться в другие локусы их естественными эндогенными кофакторами. Таким образом, сокращение времени пребывания ETR в клетке-мишени может снизить не только вероятность связывания DBD с нецелевыми сайтами, но и вероятность взаимодействия ETR с эндогенными кофакторами, с потенциальными преимуществами с точки зрения специфичности и недостатков с точки зрения целевой активности. Наконец, по сравнению с образцами, обработанными имитационной обработкой, некоторые транскрипционные и менее вероятные изменения метилирования CpG, измеренные в молчащих клетках, могут быть просто получены в результате депривации гена-мишени. Они не считаются нецелевыми для технологии глушения. Для их идентификации необходимо также включить в экспериментальную панель 8,9,10 разрушение генов искусственной нуклеазой. Биологические изменения, вызванные функциональной потерей гена-мишени, будут общими между эпигенетическим подавлением и этой альтернативной технологией.
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают благодарность Анджело Амабилье, Паоле Капассо, Иларии Казерта, Тане Бачега, Алисе Рескинья, Валерии Моллике и Деборе Сиприа за совместные усилия по разработке технологии эпигенетического подавления на протяжении многих лет; Деян Лазаревич (Dejan Lazarevic) и Франческа Джаннезе (Francesca Giannese) за критический обзор анализов RNA-seq и MeDIP-seq, описанных в протоколе. Эта работа была поддержана грантами А.Л. от Фонда «Телемарафон» (грант TIGET No F1) и программы ЕС «Горизонт 2020» (UPGRADE). Иллюстрации были созданы с помощью BioRender.com.
ВКЛАД АВТОРОВ
A.M., M.A.C., F.G. и A.C. внесли свой вклад в разработку протокола и написание рукописи; С.В., И.М. и Д.К. разработали разделы протокола по биоинформатике и отредактировали рукопись; А.М. и А.Л. разработали протокол, задумали и написали рукопись при участии всех авторов.
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab |
ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |