Aqui, apresentamos um protocolo para a seleção in vitro de repressores transcricionais projetados (ETRs) com alta, longa duração, estável, eficiência de silenciamento no alvo e baixa atividade fora do alvo em todo o genoma. Esse fluxo de trabalho permite reduzir um repertório inicial e complexo de ETRs candidatos a uma lista curta, adequada para avaliação adicional em cenários terapeuticamente relevantes.
A inativação gênica é fundamental para o estudo da função gênica e representa uma estratégia promissora para o tratamento de uma ampla gama de doenças. Entre as tecnologias tradicionais, a interferência do RNA sofre com a revogação parcial do alvo e a exigência de tratamentos ao longo da vida. Em contraste, nucleases artificiais podem impor inativação gênica estável através da indução de uma quebra de fita dupla de DNA (DSB), mas estudos recentes estão questionando a segurança dessa abordagem. A edição epigenética direcionada por meio de repressores transcricionais projetados (ETRs) pode representar uma solução, pois uma única administração de combinações específicas de ETR pode levar a silenciamento durável sem induzir quebras de DNA.
ETRs são proteínas contendo um domínio programável de ligação ao DNA (DBD) e efetores de repressores transcricionais de ocorrência natural. Especificamente, uma combinação de três ETRs equipados com o domínio KRAB do ZNF10 humano, o domínio catalítico do DNMT3A humano e DNMT3L humano, mostrou induzir estados epigenéticos repressivos hereditários no gene alvo do ETR. A natureza hit-and-run dessa plataforma, a falta de impacto na sequência de DNA do alvo e a possibilidade de reverter ao estado repressivo por desmetilação de DNA sob demanda, tornam o silenciamento epigenético uma ferramenta revolucionária. Uma etapa crítica é a identificação da posição adequada das ETRs no gene alvo para maximizar o silenciamento no alvo e minimizar o silenciamento fora do alvo. Realizar essa etapa no cenário pré-clínico final ex vivo ou in vivo pode ser complicado.
Tomando o sistema CRISPR/Cas9 cataliticamente morto como um DBD paradigmático para ETRs, este artigo descreve um protocolo que consiste na triagem in vitro de RNAs guia (gRNAs) acoplados à combinação triplo-ETR para silenciamento eficiente no alvo, seguido pela avaliação do perfil de especificidade genômica de top hits. Isso permite reduzir o repertório inicial de gRNAs candidatos a uma pequena lista de promissores, cuja complexidade é adequada para sua avaliação final no cenário de interesse terapeuticamente relevante.
A inativação gênica tem tradicionalmente desempenhado um papel fundamental no estudo da função gênica em modelos celulares e animais. Além disso, nas últimas duas décadas, com o surgimento da terapia gênica, ela tem sido proposta como uma abordagem potencialmente revolucionária para tratar doenças causadas por mutações de ganho de função1, doenças infecciosas2 ou patologias nas quais o silenciamento de um gene pode compensar um defeito hereditário em outro3. Finalmente, a inativação genética de reguladores-chave da aptidão celular e do controle funcional tem sido proposta para aumentar a eficiência de produtos celulares para imunoterapia do câncer4 e medicina regenerativa5.
Dentre as diferentes tecnologias para realizar a inativação gênica, uma das mais promissoras é osilenciamento epigenético direcionado6,7. No centro dessa tecnologia estão os chamados repressores transcricionais projetados (ETRs), proteínas quiméricas que consistem em um domínio programável de ligação ao DNA (DBD) e um domínio efetor (ED) com função repressiva epigenética. Proteínas de dedo de zinco (ZFPs)8, efetores do tipo ativador de transcrição (TALEs)9 ou DBDs baseados em CRISPR/dCas910 podem ser projetados para conectar seletivamente o DE à sequência promotor/intensificadora do gene alvo a ser silenciado. Uma vez lá, a DE da ETR realiza sua atividade silenciadora impondo marcas epigenéticas repressivas indutoras de heterocromatina, como modificações de histonas (metilação de H3K9 11,12 ou H3K27 13, desacetilação de H3 ou H4 14) e metilação do DNA CpG 15, de acordo com o domínio repressivo utilizado.
Em particular, inspirados pelos processos moleculares de repressão transcricional permanente de retrovírus endógenos que ocorrem no embrião pré-implantação16, uma combinação de três ETRs foi gerada para explorar os seguintes DEs: i) o domínio Krüppel-associated box (KRAB) do ZNF10 humano; ii) o domínio catalítico da DNA metiltransferase 3A humana de novo (DNMT3A); e iii) o DNA humano metiltransferase 3-like (DNMT3L). O KRAB é um domínio repressivo conservado compartilhado por várias ZFPs em vertebrados superiores17,18, cuja atividade de silenciamento é baseada principalmente em sua capacidade de recrutar KAP1 19-uma proteína scafold que então interage com vários outros indutores de heterocromatina 20 – compreendendo o complexo de remodelamento e desacetilação de nucleossomos (NuRD) 21, a histona metiltransferase H3K9 SETDB1 22 e o leitor de metilação H3K9 HP1 23, 24, entre outros.
DNMT3A transfere ativamente grupos metil no DNA em sequências CpG25. A atividade catalítica de DNMT3A é aumentada por sua associação física com DNMT3L, um parálogo restrito a embriões e células germinativas de DNMT3A que não possui o domínio catalítico responsável pela transferência de grupo metilo26,27. A metilação do DNA em regiões ricas em CpG – referidas como ilhas CpG (CGIs) – embutidas nos elementos promotores/potencializadores de genes de mamíferos é geralmente associada ao silenciamento da transcrição28. É importante ressaltar que, uma vez depositada, a metilação da CpG pode ser herdada de forma estável ao longo da mitose por um complexo molecular baseado em UHRF1-DNMT129.
A superexpressão estável dos ETRs na célula-alvo pode ser problemática, provavelmente devido aos riscos crescentes de atividade fora do alvo e supressão de interatores endógenos de seus locais-alvo fisiológicos ao longo do tempo. Entretanto, a expressão transitória de metades de ETR único pode falhar em induzir silenciamento de longa duração com alta eficiência30, dificultando sua aplicação terapêutica. Portanto, um avanço seminal no campo foi a evidência de que a combinação das três ETRs baseadas em KRAB-, DNMT3A- e DNMT3L pode sinergizar e, mesmo quando apenas temporariamente co-entregue, impor à sequência promotora do gene alvo H3K9 e metilação de CpG. Estes são então lidos e propagados pela célula através da mitose, levando ao silenciamento hereditário em múltiplas linhagens celulares humanas e murinas, bem como células primárias cultivadas ex vivo 30.
É importante ressaltar que o silenciamento epigenético imposto pelas ETRs pode ser revertido sob demanda por desmetilação de DNA direcionada (por exemplo, recrutamento da desmetilase de DNA TET1 baseada em CRISPR/dCas9 no locus silenciado) ou farmacológica (administração do inibidor de DNA metiltransferase 5-Aza)30, um antídoto potencial em caso de eventos adversos relacionados à ETR. ETRs all-in-one contendo os três DEs baseados em KRAB-, DNMT3A- e DNMT3L também foram descritos, mostrando eficiências de silenciamento significativas em linhagens celulares31,32 contra a grande maioria dos genes codificadores de proteínas. Além disso, vários estudos empregando as ETRs relataram um alto perfil de segurança, sem grande atividade fora do alvo em termos de metilação de novo da CpG ou alteração da acessibilidade da cromatina30,31,32. No entanto, uma análise dedicada do perfil de especificidade de ETRs equipados com um DBD recém-projetado é recomendada antes de aplicações clínicas.
Do ponto de vista clínico, o silenciamento epigenético direcionado pode fornecer vantagens críticas tanto para knockdown baseado em RNA (RNAi)33 quanto para ruptura gênica baseada em nuclease artificial8. Em contraste com o RNAi, o silenciamento epigenético direcionado pode induzir a revogação total de seu alvo por célula e não requer tratamento periódico para garantir o silenciamento a longo prazo; em contraste com a ruptura gênica, ela deixa a sequência de DNA inalterada, evitando a geração de quebras de fita dupla de DNA (DSBs). Os DSBs podem, então, induzir apoptose e parada do ciclo celular, potencialmente levando a uma seleção contra células com uma via p53 funcional 34,35 e, especialmente em configurações de edição gênica multiplex, rearranjos cromossômicos35. Além disso, ao transmitir o resultado irreversível em mosaico do reparo DSB de DNA mediado por junção final não homóloga36, a ruptura gênica não pode evitar o reparo no quadro do alvo em sequências codificadoras funcionais como um dos resultados finais e, em contraste com o silenciamento epigenético, não pode ser apagada sob demanda.
Finalmente, o silenciamento epigenético tem o potencial de ampliar a gama de elementos genéticos direcionáveis para classes totalmente ou pelo menos parcialmente refratárias ao RNAi e à ruptura gênica, como elementos regulatórios não transcritos e RNAs não codificantes30,32. O primeiro passo crítico para qualquer aplicação de silenciamento epigenético direcionado é projetar um painel de ETRs cobrindo as diferentes sequências regulatórias do gene alvo e identificar as de melhor desempenho. O número de ETRs a serem testadas pode ser crucial, considerando a crescente porção do genoma que pode ser alvo das tecnologias programáveis de ligação ao DNA constantemente em desenvolvimento37. Realizar a triagem das ETRs diretamente no tipo celular para silenciar terapeuticamente o gene alvo representaria a opção mais relevante. No entanto, telas de alto rendimento podem ser tecnicamente complicadas em células primárias devido à sua sobrevivência limitada em cultura e sua capacidade de engenharia muitas vezes subótima. Telas em grande escala podem ser ainda mais inviáveis in vivo.
Uma alternativa mais prática consiste em realizar uma triagem inicial de um grande painel de ETRs em linhagens celulares facilmente projetáveis no início e, em seguida, apenas validar as mais promissoras no tipo celular terapeuticamente relevante. Uma questão paralela é a seleção de uma leitura apropriada para medir a eficiência de silenciamento dos ETRs. A avaliação direta do transcrito ou dos níveis de proteína do gene alvo por RT-qPCR, western blot ou ELISA pode ser cara e demorada e pode não ter sensibilidade suficiente, limitando sua aplicação em escalas de alto rendimento. A geração de linhagens celulares repórteres projetadas ad hoc nas quais um fluoróforo é colocado sob o controle transcricional das sequências regulatórias do gene alvo permite a exploração da abordagem baseada em citometria de fluxo para ler o silenciamento epigenético no nível de célula única e em ritmo de alto rendimento.
Seguindo essas considerações gerais, este artigo descreve um protocolo que consiste na triagem in vitro arranjada de ETRs para eficiência de silenciamento no alvo, seguido pela avaliação da atividade off-target do genoma dos principais hits. Esse fluxo de trabalho permite reduzir o repertório inicial de ETRs candidatas a uma pequena lista de promissoras, cuja complexidade é adequada para sua avaliação final no tipo celular de interesse terapeuticamente relevante.
Entre os diferentes DBDs programáveis que podem ser explorados para gerar ETRs, este protocolo se concentrará na tecnologia baseada em CRISPR/dCas9, devido à facilidade de projetar gRNAs abrangendo o promotor do gene alvo em uma escala de alto rendimento. No entanto, o mesmo fluxo de trabalho conceitual descrito abaixo pode ser adotado para avaliar a eficiência e a especificidade de ETRs equipadas com outros DBDs.
O silenciamento epigenético direcionado pode representar uma solução promissora para o tratamento de distúrbios que podem se beneficiar da inativação permanente de genes, incluindo doenças causadas por mutações de ganho de função1, doenças infecciosas2 e patologias nas quais o silenciamento de um gene pode compensar um defeito hereditário em outro3 ou liberar todo o potencial das terapias celulares adotivas4, 5º. Por atuar no nível da cromatina e ser autopropagado pela célula 7,30,32, o silenciamento epigenético pode evitar alterações tóxicas (por exemplo, rearranjos cromossômicos) da sequência de DNA do gene alvo e silenciamento parcial e transitório do alvo, que são limitações da ruptura gênica baseada em nuclease artificial8,34,35 e knockdown baseado em RNAi 33, respectivamente.
Um dos principais passos preliminares em qualquer protocolo de silenciamento epigenético é identificar a posição adequada no gene alvo para direcionar as ETRs que depositarão as marcas epigenéticas repressivas necessárias para desativar a atividade transcricional do alvo. Diferentes elementos regulatórios do sítio de início transcricional proximal e distal podem concorrer para dar suporte à saída transcricional de um determinado gene humano54. Além disso, diferentes locais-alvo por elemento regulatório específico podem agora ser identificados graças ao número crescente de tecnologias programáveis de ligação ao DNA6. Portanto, protocolos, como o descrito aqui em linhagens celulares modificadas, podem ser usados para nomear locais-alvo individuais e/ou regiões genômicas passíveis de silenciamento epigenético mediado por ETR, antes de embarcar em esforços pesados e demorados de avaliação dos melhores candidatos no cenário terapêutico final. Alguns aspectos críticos do protocolo são descritos a seguir.
Engenharia de uma linhagem celular repórter preditiva do alvo terapêutico final
Apesar da constante otimização dos protocolos de engenharia celular – necessários aqui para inserir o que codifica o repórter fluorescente no gene alvo e para entregar os ETRs – não se pode dar como certo que eles possam já estar disponíveis para a linhagem celular que mais se assemelha ao alvo terapêutico final. Nesse caso, diferentes estratégias de mitigação podem ser aplicadas: a) aproveitando kits de otimização fornecidos pelos fornecedores para otimizar internamente o protocolo de transfecção para a linhagem celular alvo; b) mudança para outras linhagens celulares que ainda expressam esse gene alvo, mas pertencentes a tecidos diferentes do alvo terapêutico final, para os quais os protocolos de engenharia foram extensivamente otimizados. Caso essas opções não estejam disponíveis, pode-se considerar a mudança para tipos celulares primários ou organoides que representam o alvo final. Como uma consideração geral para estudos pré-clínicos e aplicações terapêuticas do silenciamento epigenético baseado em ETR, cenários em que o gene alvo é essencial para o tipo de célula-alvo devem ser descartados. O silenciamento completo e a longo prazo de um gene essencial imposto pelas ETRs levará à contraseleção das células-alvo ao longo do tempo (e, potencialmente, toxicidade do tratamento). Tecnologias alternativas que fornecem revogação parcial de alvos, como o RNAi33, são preferidas nesses casos.
Avaliação da atividade de silenciamento no alvo das ETRs
ETRs baseados na combinação de domínios efetores KRAB, DNMT3A e DNMT3L provaram ser eficazes contra a grande maioria dos genes codificadores de proteínas, com uma ampla janela de direcionamento permissiva de cerca de 1 quilobase centrada no local de início da transcrição32. Para se ter uma noção de como é um experimento de silenciamento epigenético bem realizado, os detalhes técnicos e os resultados do silenciamento do gene B2M em células K-562 são fornecidos aqui. Isso pode ser considerado um controle positivo importante a ser incluído não apenas por pesquisadores que trabalham com células K-562, mas também por aqueles que se aproximam da tecnologia baseada em ETR pela primeira vez. Conforme declarado no protocolo, a ruptura gênica baseada em nuclease artificial (por exemplo, CRISPR/Cas9) é recomendada como um controle adicional da eficiência da entrega gênica no tipo celular de interesse e do fenótipo de células privadas do gene alvo. Após a triagem inicial de gRNAs a serem acoplados aos ETRs baseados em CRISPR/dCas9, se nenhum dos gRNAs testados for capaz de silenciar permanentemente o gene alvo, deve-se considerar, na seguinte ordem: 1) aumentar a quantidade de gRNAs e ETRs entregues; 2) testar pools dos principais gRNAs procurando efeitos sinérgicos entre eles. Se o silenciamento em longo prazo ainda não for alcançado, deve-se considerar: 3) testar gRNAs adicionais, que podem ter como alvo locais mais relevantes para instruir o silenciamento epigenético; 4) mudança para plataformas DBD baseadas em ZFP8 ou TALE9, que podem ter uma capacidade de ligação melhorada à cromatina alvo; 5) mudança de transitório para estável – por exemplo, integrando a expressão baseada em vetores virais dos ETRs (os construtos de fusão gRNA ou dCas9 ou ambos ao adotar a tecnologia CRISPR/dCas9). Uma vez que nosso grupo desenvolveu e tem experiência robusta com a co-entrega das três ETRs30 separadas, o protocolo e os resultados mostrados aqui são baseados nessa abordagem. No entanto, um fluxo de trabalho conceitual semelhante pode ser provavelmente aplicado para um sistema baseado em CRISPR tudo-em-um32.
Avaliação da atividade fora do alvo das ETRs
Vários estudos têm demonstrado indicações preliminares in vitro da especificidade de ETRs baseadas na combinação dos domínios efetores KRAB, DNMT3A e DNMT3L30,31,32. No entanto, se entre os gRNAs testados, nenhum deles mostrar um perfil de especificidade satisfatório em termos de regulação transcricional e/ou metilação de novo do DNA, pode-se buscar duas estratégias não mutuamente exclusivas: a) reduzir o tempo de residência dos ETRs dentro da célula (e, consequentemente, sua potencial atividade fora do alvo) diminuindo as doses de ETRs ou testando sistemas alternativos de liberação. Por exemplo, em comparação com os plasmídeos, espera-se que tanto o RNAm quanto a entrega de proteínas reduzam o tempo de exposição celular aos ETRs e, consequentemente, a probabilidade de atividade fora do alvo55; b) mudança para variantes Cas9 mais recentes, otimizadas para reduzir a ligação fora do alvo da plataforma56, ou para tecnologias alternativas de ligação de DNA baseadas em ZFP8 ou TALE9. É importante considerar que, em comparação com amostras tratadas simuladamente, a atividade no alvo e fora do alvo do silenciamento gênico é afetada não apenas pela ligação do DBD à sua sequência alvo, mas também pela capacidade potencial dos domínios efetores epigenéticos de serem recrutados para outros loci por seus cofatores endógenos naturais. Portanto, reduzir o tempo de residência dos ETRs na célula-alvo pode diminuir não apenas a probabilidade de ligação do DBD a locais fora do alvo, mas também a probabilidade de os ETRs interagirem com cofatores endógenos, com potenciais benefícios em termos de especificidade e desvantagens em termos de atividade no alvo. Finalmente, em comparação com amostras tratadas simuladamente, algumas das alterações transcricionais e menos prováveis de metilação de CpG medidas em células silenciadas podem ser simplesmente derivadas pela privação do gene alvo. Estes não são considerados off-targets da tecnologia de silenciamento. Para identificá-los, deve-se incluir também a ruptura gênica por nuclease artificial no painel experimental 8,9,10. Alterações biológicas decorrentes da perda funcional do gene alvo serão compartilhadas entre o silenciamento epigenético e esta tecnologia alternativa.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem a Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica e Deborah Cipria pelo esforço colaborativo no desenvolvimento da tecnologia de silenciamento epigenético ao longo dos anos; Dejan Lazarevic e Francesca Giannese para revisão crítica das análises de RNA-seq e MeDIP-seq descritas no protocolo. Este trabalho foi apoiado por subvenções a A.L. da Fundação Telethon (bolsa TIGET n.º F1) e do Programa Horizonte 2020 da UE (UPGRADE). Ilustrações foram criadas com BioRender.com.
CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES
A.M, M.A.C., F.G. e A.C. contribuíram na elaboração do protocolo e redação do manuscrito; S.V., I.M. e D.C. desenharam as seções de bioinformática do protocolo e revisaram o manuscrito; A.M. e A.L. elaboraram o protocolo, conceberam e escreveram o manuscrito com a contribuição de todos os autores.
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab |
ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |