Aquí se presenta un protocolo para cuantificar de forma fiable la función ventricular derecha e izquierda de los corazones de donantes después de la conservación en frío utilizando un sistema de perfusión ex vivo .
La disfunción primaria del injerto (DGP) sigue siendo la principal causa de muerte prematura tras el trasplante de corazón. El tiempo isquémico prolongado durante la conservación en frío es un factor de riesgo importante para el DGP, y la evaluación fiable de la función cardíaca es esencial para estudiar las respuestas funcionales del corazón del donante después de la conservación en frío. El vídeo adjunto describe una técnica para evaluar la función ventricular derecha e izquierda murina mediante perfusión ex vivo basada en un modelo de Langendorff después de la conservación en frío durante diferentes duraciones. En resumen, el corazón se aísla y se almacena en una solución fría de histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK). A continuación, el corazón se perfunde con un tampón de Kreb en un modelo de Langendorff durante 60 min. Se inserta un balón de silicona en el ventrículo izquierdo y derecho, y se registran los parámetros funcionales cardíacos (dP/dt, relaciones presión-volumen). Este protocolo permite la evaluación fiable de la función cardíaca después de diferentes protocolos de preservación cardíaca. Es importante destacar que esta técnica permite el estudio de las respuestas de preservación cardíaca específicamente en células cardíacas nativas. El uso de corazones murinos muy pequeños permite el acceso a una enorme variedad de ratones transgénicos para investigar los mecanismos del DGP.
El trasplante cardíaco mejora la supervivencia y la calidad de vida en pacientes con insuficiencia cardíaca terminal1. Desafortunadamente, la escasez de donantes de corazón limita el número de pacientes que podrían beneficiarse de esta terapia y limita la capacidad de los médicos para hacer coincidir de manera óptima a los donantes con los receptores 2,3,4. Además, el nuevo sistema de asignación ha contribuido a prolongar los tiempos de isquemia y ha aumentado significativamente el uso de donantes marginales desde 20185. En consecuencia, la edad media de los donantes de corazón y el tiempo isquémico aumentan con el tiempo, lo que lleva a una mayor tasa de disfunción primaria del injerto (DGP) a pesar de las mejoras significativas en las estrategias de preservación del corazón 6.
El DGP puede afectar al ventrículo izquierdo, al derecho o a ambos, y sigue siendo una complicación potencialmente mortal que representa la principal causa de muerte prematura después de un trasplante de corazón. La investigación de los mecanismos de la PDG y el desarrollo de estrategias para una mejor preservación del corazón son consideraciones importantes, dado el impacto potencial para salvar vidas en los receptores de corazón. Por lo tanto, los modelos experimentales que permiten una evaluación robusta y fiable de la función cardíaca del donante después de un tiempo de almacenamiento prolongado son esenciales para aumentar nuestra comprensión del DGP y facilitar el desarrollo de nuevas terapias. La capacidad de evaluar con precisión la función cardíaca en el corazón del ratón permite acceder a un vasto repertorio de modelos murinos transgénicos que pueden identificar con precisión los mecanismos del DGP.
En estudios fisiológicos y farmacológicos, el modelo de perfusión retrógrada de Langendorff es ampliamente utilizado para evaluar la función cardíaca7. Específicamente, el rendimiento cardíaco se detecta mediante un balón de silicona conectado a un transductor de presión dentro de la cavidad ventricular izquierda (VI). Una característica clave del DGP es la contracción y relajación inadecuadas del músculo ventricular. Los estudios previos de Langendorff se han centrado en el uso de un balón del VI para producir resultados fiables y reproducibles en la evaluación funcional del VI 8,9,10. Sin embargo, el uso de un balón intracavitario para evaluar la función del ventrículo derecho (VD) mediante el sistema de balón es menos reconocido.
Dada una tasa significativa de DGP que afecta al VD después del trasplante11, los métodos experimentales para estudiar la función tanto del VI como del VD ayudarían a determinar los mecanismos moleculares y fisiológicos que contribuyen al DGP del VD. Este protocolo muestra que los balones de silicona intracavitarios pueden proporcionar evaluaciones fiables de la función del VI y del VD en el mismo corazón murino12. Para evaluar el uso potencial del sistema de Langendorff en el estudio de DGP, examinamos las funciones cardíacas con diferentes períodos de almacenamiento y encontramos una disminución de la función cardíaca en la contracción y relajación con el almacenamiento prolongado en frío de los corazones murinos. Curiosamente, el VI tiene una mayor reducción funcional que el VD. En resumen, el protocolo descrito aquí se puede utilizar para evaluar el efecto de un fármaco candidato y las vías moleculares en la función del VI y del VD. La capacidad de utilizar este método en corazones murinos facilitará la realización de estudios mecanicistas detallados.
Este protocolo describe el método de Langendorff de perfusión retrógrada mediante canulación aórtica. Esta técnica se puede utilizar para evaluar la función del VI y el VD de los corazones murinos después del almacenamiento en frío. Los resultados muestran que el almacenamiento prolongado en frío de los corazones de los donantes conduce a una reducción de la función cardíaca tanto en el VI como en el VD utilizando este protocolo.
Los estudios de rechazo agudo y crónico después del trasplante cardíaco se centran ampliamente en la inmunobiología14. Los efectos de las células nativas sobre el DGP durante el almacenamiento en frío están menos bien examinados. El DGP ocurre en ~10%-20% de los trasplantes de corazón y representa el 66% de las muertes prematuras dentro de los 30 días posteriores al trasplante. En particular, la incidencia de DGP que afecta al VI frente al VD difiere después del trasplante11. Sin la contribución de las respuestas celulares receptoras, este método ex vivo se centra en las contribuciones de las células cardíacas nativas al DGP después de la preservación en frío de los corazones de los donantes. Es posible que otros estudios incorporen las respuestas de los receptores en un modelo de trasplante cardíaco murino.
En este protocolo, la perfusión de Langendorff de corazones de donantes conservados en frío se centró en las respuestas cardíacas nativas a la perfusión cristaloide caliente sin infiltrar la inmunidad celular. Para lograr resultados reproducibles, se estandarizaron varios pasos críticos. Los corazones de ratón se detuvieron con una solución de HTK y se almacenaron en HTK helado, de forma similar a la práctica clínica. El volumen de perfusión y el tiempo de infusión de la solución HTK para cada corazón se monitorizaron de cerca con un temporizador. El corazón del donante se mantuvo en tubos preenfriados sobre hielo que contenía HTK en una habitación a 4 °C. El tiempo de canulación se estandarizó a ~3 min antes de la perfusión. Todos estos pasos aseguraron que la duración de la conservación en frío fuera la variable principal en el estudio.
Un período de contractilidad cardíaca irregular durante ~20 min se observó comúnmente al comienzo de la perfusión. Este período de equilibrio y recuperación se vio facilitado por el calentamiento gradual y la oxigenación de los tejidos cardíacos. Se esperaba un período relativamente estable después de los 20 minutos iniciales. El balón se insertó en la cavidad ventricular a ~18 min después del período de equilibrio inicial. Comenzamos a registrar la hemodinámica después de que el corazón estuviera estable durante ~ 25 minutos, una vez que se insertó el balón. La perfusión con tampón KH mantuvo un rendimiento cardíaco estable durante ~1,5-2 h. Por lo tanto, se optó por registrar la hemodinámica durante 20 min en cada uno de los ventrículos izquierdo y derecho.
Existen varias limitaciones de la perfusión retrógrada para estudiar el DGP de los corazones después del almacenamiento en frío. En primer lugar, debido al tamaño del balón y a la falta de espacio en cada cavidad ventricular (en particular, en el VD), la inserción simultánea de dos balones tanto en el VI como en el VD es muy difícil. Por lo tanto, medimos la función del VD y el VI secuencialmente. Es importante tener en cuenta que el tabique interventricular contribuye significativamente a la función ventricular izquierda y derecha. El tabique contribuye al ~50% de la función ventricular derecha, por lo que existe dependencia interventricular15. También es importante tener en cuenta que, mientras que los procedimientos para la reperfusión del corazón murino en el dispositivo Langendorff duran ~3 min, la implantación quirúrgica del corazón humano en el campo quirúrgico relativamente cálido tarda ~45 min. En comparación, el corazón murino en este sistema de Langendorff incurre en menos tiempo isquémico. Esto debe tenerse en cuenta a la hora de considerar la traslación clínica.
Dado que usamos el tampón KH para perfundir el corazón sin sangre, esto también puede tener menos eficiencia en el suministro de oxígeno. Sin embargo, la función cardíaca es relativamente estable durante las 1,5-2 h iniciales de perfusión, lo que permite mediciones hemodinámicas fiables. Desafortunadamente, actualmente no existen modelos viables de perfusión cardíaca que funcionen para estos corazones murinos más pequeños, y el efecto de la carga ventricular no se puede evaluar en este sistema. A pesar de esto, el sistema de perfusión es altamente reproducible y requiere menos mano de obra y tiempo que los modelos de trasplante. También es menos costoso que los estudios de trasplante, lo que puede hacerlo más adecuado para el cribado de diferentes opciones terapéuticas y diversas vías moleculares. Con modificaciones en las soluciones de conservación mediante la adición de fármacos candidatos, esta plataforma se puede utilizar para evaluar los efectos de los agentes farmacológicos en la reducción del DGP tanto en el VI como en el VD.
The authors have nothing to disclose.
Ninguno.
4-0 silk suture | Braintree Scientific | SUTS108 | |
6-0 Silk suture | Braintree Scientific | SUTS104 | |
All purpose flour | Kroger | ||
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G | Fisher scientific | 14-826-5A | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) | Fisher scientific | 14-823-16E | |
Corn Syrup | Kroger | ||
Custodiol HTK Solution | Essential Pharmaceuticals LLC | ||
Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 14393/14394 | |
Falcon 50 mL conical tubes | Fisher scientific | 14-959-49A | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H4784 | |
Krebs Henseleit buffer | Sigma | K3753 | |
Nusil silicone dispersions | Avantor | ||
Perfusion system | Radnoti | 130101BEZ | |
PowerLab | ADInstruments | PL3508 | |
Sodium azide | Sigma | S2002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Xylazine | Sigma | X1126 |