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医学

Bewertung der biventrikulären Funktion von murinen Mäusen in einem Langendorff-Modell

Published: December 23, 2022
doi:
10.3791/64384
, , , ,
1University of Michigan, Ann Arbor, 2University of Montreal

Summary

Hier wird ein Protokoll zur zuverlässigen Quantifizierung der rechts- und linksventrikulären Funktion von Spenderherzen nach Kältekonservierung mit einem ex vivo Perfusionssystem vorgestellt.

Abstract

Die primäre Transplantatdysfunktion (PID) ist nach wie vor die häufigste Ursache für den frühen Tod nach einer Herztransplantation. Eine verlängerte ischämische Zeit während der Kältekonservierung ist ein wichtiger Risikofaktor für die PID, und eine zuverlässige Beurteilung der Herzfunktion ist unerlässlich, um die funktionellen Reaktionen des Spenderherzens nach der Kältekonservierung zu untersuchen. Das begleitende Video beschreibt eine Technik zur Beurteilung der rechts- und linksventrikulären Funktion von Mäusen mittels Ex-vivo-Perfusion in einem Langendorff-Modell nach Kältekonservierung für unterschiedliche Zeiträume. Kurz gesagt, das Herz wird isoliert und in einer kalten Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat-Lösung (HTK) gelagert. Anschließend wird das Herz in einem Langendorff-Modell für 60 min mit einem Kreb-Puffer perfundiert. Ein Silikonballon wird in die linke und rechte Herzkammer eingeführt und die kardialen Funktionsparameter (dP/dt, Druck-Volumen-Beziehungen) aufgezeichnet. Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige Beurteilung der Herzfunktion nach verschiedenen Herzerhaltungsprotokollen. Wichtig ist, dass diese Technik die Untersuchung von kardialen Erhaltungsreaktionen speziell in nativen Herzzellen ermöglicht. Die Verwendung von sehr kleinen murinen Herzen ermöglicht den Zugang zu einer enormen Anzahl transgener Mäuse, um die Mechanismen der PID zu untersuchen.

Introduction

Die Herztransplantation verbessert das Überleben und die Lebensqualität von Patienten mit Herzinsuffizienz im Endstadium1. Leider begrenzt der Mangel an Herzspendern die Anzahl der Patienten, die von dieser Therapie profitieren könnten, und schränkt die Fähigkeit der Ärzte ein, Spender und Empfänger optimal zusammenzubringen 2,3,4. Darüber hinaus hat das neue Zuteilungssystem zu längeren ischämischen Zeiten beigetragen und den Einsatz von marginalen Spendern seit 2018 deutlich erhöht5. Folglich nehmen das Durchschnittsalter der Herzspender und die ischämische Zeit im Laufe der Zeit zu, was trotz signifikanter Verbesserungen in den Strategien zur Herzerhaltung zu einer höheren Rate an primären Transplantatdysfunktionen (PID) führt 6.

Die PID kann den linken, den rechten oder beide Ventrikel betreffen und ist nach wie vor eine lebensbedrohliche Komplikation, die die Hauptursache für frühe Todesfälle nach einer Herztransplantation darstellt. Die Untersuchung der Mechanismen der PDG und die Entwicklung von Strategien für eine bessere Herzerhaltung sind angesichts der potenziell lebensrettenden Auswirkungen auf Herzempfänger wichtige Überlegungen. Daher sind experimentelle Modelle, die eine robuste und zuverlässige Beurteilung der Spenderherzfunktion nach längerer Lagerzeit ermöglichen, unerlässlich, um unser Verständnis der PID zu verbessern und die Entwicklung neuartiger Therapien zu erleichtern. Die Fähigkeit, die Herzfunktion im Mausherzen genau zu beurteilen, ermöglicht den Zugang zu einem breiten Repertoire an transgenen Mausmodellen, die PID-Mechanismen genau identifizieren können.

In physiologischen und pharmakologischen Studien wird das retrograde Langendorff-Perfusionsmodell häufig zur Beurteilung der Herzfunktion verwendet7. Konkret wird die Herzleistung durch einen Silikonballon erfasst, der mit einem Druckwandler in der linksventrikulären (LV) Höhle verbunden ist. Ein wesentliches Merkmal der PID ist die unzureichende Kontraktion und Entspannung des Ventrikelmuskels. Frühere Langendorff-Studien konzentrierten sich auf die Verwendung eines LV-Ballons, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse bei der LV-Funktionsbeurteilung zu erzielen 8,9,10. Die Verwendung eines intrakavitären Ballons zur Beurteilung der rechtsventrikulären (RV) Funktion mit dem Ballonsystem ist jedoch weniger bekannt.

Angesichts einer signifikanten PID-Rate, die die RV nach der Transplantation betrifft11, würden experimentelle Methoden zur Untersuchung sowohl der LV- als auch der RV-Funktion dazu beitragen, die molekularen und physiologischen Mechanismen zu bestimmen, die zur RV-PID beitragen. Dieses Protokoll zeigt, dass intrakavitäre Silikonballons zuverlässige Beurteilungen der LV- und RV-Funktion im selben murinen Herzen liefern können12. Um den möglichen Einsatz des Langendorff-Systems in der PID-Studie zu evaluieren, untersuchten wir die Herzfunktionen mit unterschiedlichen Speicherzeiten und fanden eine verminderte Herzfunktion bei Kontraktion und Entspannung bei längerer Kältelagerung von murinen Herzen. Interessanterweise hat der LV eine höhere Funktionsreduktion als der RV. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Protokoll verwendet werden kann, um die Wirkung eines Wirkstoffkandidaten und molekularer Signalwege sowohl auf die LV- als auch auf die RV-Funktion zu bewerten. Die Möglichkeit, diese Methode auf Mäuseherzen anzuwenden, wird die Durchführung detaillierter mechanistischer Studien erleichtern.

Protocol

Alle Tierversuche in diesem Protokoll wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Michigan, Ann Arbor, genehmigt. Alle Mäuse wurden mit einem Lichtzyklus von 12:12 in pathogenfreien Räumen untergebracht. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Tieren und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden. 1. Aufbau des Silikon-Ballonkatheters HINWEIS: Der Silikonballon wird wie zuvor13 beschrieben hergestellt. 9,5 ml destilliertes Wasser, 14,2 ml leichten Maissirup und 33,8 g Saccharose in ein 100-ml-Becherglas geben. Erhitzen und rühren Sie die Lösung, bis sich der Zucker vollständig aufgelöst hat. Bereiten Sie den Teig vor, indem Sie 10 g Weizenmehl und 5 g Wasser mischen, bis eine gleichmäßige Konsistenz erreicht ist, und 10 Minuten ruhen lassen. Ein kleines Stück Teig zu einem ovalen “Kopf” formen und am Ende eines trockenen Spaghettistrangs befestigen. Tauchen Sie dann diesen Kopf in die Zuckerlösung und nehmen Sie ihn langsam aus der Lösung, da der Kopf nun vollständig bedeckt ist.HINWEIS: Der Teig sollte glatt und gleichmäßig sein. Die Teiggrößen können variiert werden, um verschiedene Ballongrößen zu erzeugen, von 5 mm (kurzer Durchmesser) bis 7 mm (langer Durchmesser). Versuchen Sie, sie mit einem dünnen Film Zuckerlösung zu bedecken. Hängen Sie den Spaghettistrang an einem Styroporschaumblock oder anderen Haltern auf, um eine glänzende Hülle gleichmäßig über dem Kopf zu bilden und über Nacht trocknen zu lassen. Tauchen Sie die Form in Silikondispersion (Silikonelastomer, das in Xylol dispergiert ist). Den Spaghettistrang bei 37 °C für 2 h oder bis zum Trocknen wieder in den Styroporschaumblock legen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.HINWEIS: Es ist unbedingt zu verhindern, dass das Silikondispersionsgel durch Lufteinwirkung oxidiert, da dies zu einer ungleichmäßigen Ballondicke führt. Lege die Form in das Wasser, um den Ballon zu trennen und aufzufangen. Lagern Sie den Ballon in 0,02%igem Natriumazid. Schneiden Sie eine Spitze mit zwei stumpfen Enden von einer 22-g-Nadel ab; Befestigen Sie ein stumpfes Ende am Silikonballon und ein weiteres stumpfes Ende am PE-Schlauch. Verwende 4-0 Seide, um den Ballon auf der Nadel festzubinden.HINWEIS: Testen Sie die Unversehrtheit des Ballons, indem Sie Wasser in den Ballon injizieren. Sobald der Ballon gefüllt ist, drücken Sie den Ballon sanft, um zu testen, ob der Ballon die Spannung im Inneren aufrechterhält. Verwenden Sie einen neuen Ballon, wenn er undicht ist. Die montierten Ballons können für die spätere Verwendung aufbewahrt werden. 2. Vorbereitung des Herzperfusionssystems 1 L Krebs-Henseleit (KH) Perfusionspuffer herstellen und in den Wasserbehälter Langendorff-System überführen. Schließen Sie den Luftschlauch an den Wasserbehälter an und schalten Sie den Luftstrom ein, um den KH-Puffer mit 5 % CO2 und 95 %O2 für mindestens 30 Minuten auszugleichen. Stellen Sie das Wasserbad auf 41,5 °C ein und lassen Sie das Wasser in der äußeren Schicht des Langendorff-Systems zirkulieren, um das System und den KH-Puffer zu erwärmen.HINWEIS: Die Wasserbadtemperatur muss für jedes System optimiert werden. Bei diesem System hält die Wasserbadtemperatur die KH bei 37-37,5 °C, wenn sie in das Herz eindringt. 3. Isolierung, Montage und Kanülierung des Mausherzens Zur Antikoagulation verabreichen Sie 200 Einheiten Heparin in Kochsalzlösung durch intraperitoneale (i.p.) Injektion in den rechten Quadranten des C57/B6-Mäuseabdomens. Saugen Sie die Spritze vor der Injektion ab, um sicherzustellen, dass sich die Abschrägung der Nadeln nicht in der Blase oder im Lumen des Magen-Darm-Trakts befindet. Verwenden Sie mindestens vier Mäuse in jeder Versuchsbedingung (aber berücksichtigen Sie auch die Größe des Behandlungseffekts).Nach 30 Minuten werden 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin i.p. verabreicht, um die Maus zu betäuben. Überprüfen Sie, ob die betäubte Maus bewusstlos ist, indem Sie die Zehen kneifen und sicherstellen, dass keine Reaktion beobachtet wird. Acepromazin 2 mg/kg kann dem Ket/Xyl-Cocktail zugesetzt werden, wenn der verwendete Mäusestamm kein ausreichendes Anästhesieniveau nur mit Ket/Xyl erreicht. Machen Sie einen Schnitt direkt unter dem Brustbein. Verwende eine Schere, um den Brustkorb zu öffnen, indem du das Zwerchfell und die Rippen durchschneidest. Falten Sie die vordere Brustwand, um den Brustkorb vollständig freizulegen. Schnitt an der absteigenden Aorta (geschlossen zum Aortenbogen). Übertragen Sie das Herz, die Lunge und die Thymusdrüse der Maus in einen kalten Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat-Puffer (HTK). Isolieren Sie die Organe unter eiskaltem HTK-Puffer. Legen Sie die Aorta frei, indem Sie jegliches Bindegewebe entfernen.HINWEIS: Maximieren Sie die Länge der Aorta, indem Sie sowohl die aufsteigende Aorta als auch die Aortenbogenregion in die Exzision einbeziehen, um genügend Platz für eine Verbindung mit einer Nadel zu haben. Verbinden Sie das Ende der Aorta mit einer 22-G-Nadel und binden Sie sie mit einer 6-0-Seidennaht. Stellen Sie sicher, dass sich die Kanüle über der Aortenwurzel befindet, um die Aortenklappe nicht zu beeinträchtigen. Die Aorta über ca. 10 min mit 10 ml kaltem (4 °C) HTK-Puffer perfundieren.HINWEIS: Es dauert weniger als 15 Minuten von der Herzentfernung bis zur Kanülierung der Aorta; Es ist jedoch wichtig, die Perfusionsgeschwindigkeit auf dem entsprechenden Niveau zu halten. Zu schnelle und kräftige Injektionen können hohe Drücke erzeugen und Gefäß-/Herzschäden verursachen. Bewahren Sie das Herz 8 h lang in einem 50-ml-Röhrchen mit eiskaltem HTK auf oder führen Sie die Perfusion sofort durch (bewahren Sie die Kontrolle nicht auf) und vermeiden Sie den direkten Kontakt mit Eis.HINWEIS: Der direkte Kontakt des Herzgewebes mit Eis kann zu Kälteverletzungen führen. Verbinden Sie das Nadelherz mit der Kanüle im Langendorff-Apparat und binden Sie es mit einem Seidenfaden zusammen.HINWEIS: Um das Verfahren zu standardisieren, warten Sie vor der Perfusion insgesamt 3 Minuten für den Kanülierungsprozess. Beginnen Sie die Perfusion mit einem konstanten Durchflussmodus von 3 ml/min; Wechseln Sie dann in den Konstantdruckmodus bei 70-80 mmHg und stellen Sie das Herz auf ~6 ml/min ein.HINWEIS: Das sanfte Abtasten des Herzens kann helfen, die Herzreanimation zu beschleunigen. Wenn die Perfusionsflussrate im Konstantdruckmodus viel höher als 6 ml/min ist, könnte ein Leck in der Kanüle vorliegen oder die Aortenklappe funktioniert nicht richtig. Passen Sie die Anschlüsse an, um das Leck zu beheben. Der Konstantflussmodus setzt die Selbstregulierung des Gefäßtonus des Herzens außer Kraft. Der Konstantdruckmodus ermöglicht es dem Herzen, seinen koronaren Perfusionsfluss zu regulieren. Daher wird der Konstantdruckmodus die Herzfunktion und die Erhaltungsqualität des Herzens präzise messen. Verbinden Sie einen entleerten, mit Wasser gefüllten Ballon mit einem Druckaufnehmer und einer mit Wasser gefüllten Spritze mit einem Drei-Wege-Wasserhahn. Nach einer Äquilibrierungszeit von 15-20 Minuten durchtrennen Sie den rechten Vorhof (RA) und führen den Ballon durch die RA in das Wohnmobil ein. Verwenden Sie Klebeband, um den Ballon im Wohnmobil zu halten. Minimieren Sie den offenen Bereich der RA, um den Ballon in der Herzkammer einzuengen (siehe Abbildung 1 für den Aufbau).HINWEIS: Eine Ausgleichsphase ist notwendig, da die Herzkontraktion und -entspannung zu Beginn nicht stabil sind und die Messung weniger genau und repräsentativ ist. Wenn der AV-Knoten während der Eröffnung der RA beschädigt wird, zeigt das Herz häufige Arrhythmien. Nach 20 Minuten der RV-Funktionsdatenerfassung wird der linke Vorhof (LA) durchtrennt und ein entleerter, mit Wasser gefüllter Ballon durch den LA in den LV eingeführt. Verwende Klebeband, um den Ballon im LV zu halten.HINWEIS: Das Herz sollte die Hämodynamik länger als 1,5 h stabil halten. 4. Funktionsdatenerfassung Kalibrierung des DruckaufnehmersFüllen Sie eine 10-ml-Spritze mit warmer Kochsalzlösung und verbinden Sie die Spritze über einen Drei-Wege-Wasserhahn mit der Kuppel. Öffnen Sie den Wasserhahn und füllen Sie die Kuppel langsam mit Kochsalzlösung, schließen Sie dann alle Wasserhähne und entfernen Sie die Spritze. Befestigen Sie die gefüllte Kuppel am Wandler. Schließen Sie das Manometer an das dritte Ende des Dreiwegehahns an. Wählen Sie in der Aufnahmesoftware den Bridge-Verstärker aus dem Dropdown-Menü des Kanals aus, der mit dem Schallwandler verbunden ist. Benennen Sie den Kanal in Perfundierter Druck um. Klicken Sie auf Null, um den Wandler auf Null zu setzen. Starten Sie die Aufzeichnung, indem Sie auf Start klicken, so dass der Wandler nun 0 mmHg anzeigt. Schieben Sie nach einigen Sekunden der Aufzeichnung langsam auf die Spritze und erhöhen Sie den Druck auf 100. Klicken Sie auf Stopp , um die Aufnahme zu beenden. Wählen Sie im Dialogfeld “Einheitenumrechnung” einen Aufnahmebereich für 0 mmHg aus, klicken Sie auf den Pfeil zu Punkt 1 und geben Sie 0 mmHg ein. Wählen Sie den Aufzeichnungsbereich für 100 mmHg aus, klicken Sie auf den Pfeil zu Punkt 2 und geben Sie 100 mmHg ein. Klicken Sie auf OK, um den Wandler zu kalibrieren. Benennen Sie den Kanal, der dem Druckaufnehmer mit dem Ballon entspricht, in Ventrikeldruck um. Starten Sie die Aufnahme, wenn das Herz mit dem System verbunden ist. Nachdem Sie den Ballon in die Herzkammer eingeführt haben, stellen Sie die Wassermenge im Ballon mit einer Mikrometerspritze durch den Drei-Wege-Wasserhahn ein, um den enddiastolischen Druck bei 5-10 mmHg zu halten.HINWEIS: Die enddiastolische Messung kann während der Messung abnehmen, vorzugsweise ab etwa 10 mmHg. Benennen Sie einen leeren Kanal in dP/dt um. Wählen Sie im Dropdown-Menü Derivat | Quellkanal als Ventrikeldruck aus. Der Kanal zeichnet das Verhältnis der Druckänderung in der Ventrikelhöhle während der Kontraktionsphase auf. Wählen Sie einen stabilen Messzeitraum aus und klicken Sie dann im Blutdruckmodul auf Einstellung.Wählen Sie den Ventrikeldruck als Eingangskanal aus und klicken Sie auf Auswahl für einen Berechnungszeitraum | OK. Klicken Sie auf Klassifikatoransicht , um den Ausreißer-Herzzyklus (z. B. abnormale Zykluszeit oder abnormaler Druck) zu entfernen. Klicken Sie auf die Tabellenansicht , um die Tabellen mit dem Mittelwert von max dP/dt (Kontraktion) und min dP/dt (Relaxation) für den ausgewählten Zeitraum zu generieren.HINWEIS: Speichern Sie die Aufzeichnungsdatei für jede Probe und speichern Sie die Tabelle der durchschnittlichen Herzfunktion für statistische Analysen.

Representative Results

Ausgewachsene C57Bl/6 Mäuseherzen, 3 Monate alt, wurden entnommen und in das Langendorff-System eingebaut. Das Spenderherz wurde für 0 und 8 h in HTK gelagert und dann mit sauerstoffhaltigem KH-Puffer perfundiert. Ein Silikonballon, der mit einem Druckwandler verbunden ist, wurde verwendet, um die Kontraktion und Entspannung der LV- und RV-Funktion zu messen. Der Aortendruck wurde im Bereich von 70-80 mmHg gehalten. Die Herzfrequenz war vergleichbar bei Mäuseherzen mit 0 und 8 h Speicherzeit. Die LV- und RV-Funktion wurde durch Messung des systolischen und diastolischen Drucks untersucht. dP/dt, eine Ableitung zur Berechnung des Verhältnisses der Druckänderung, wurde berechnet, um die Druckdynamik zu bestimmen. Die absolute Zahl der maximalen dP/dt und der minimalen dP/dt könnte den Grad der Muskelkontraktion und -entspannung darstellen. Bei einer Lagerung von 0 h hatte der LV einen höheren systolischen Druck als der RV (Abbildung 2C und Abbildung 3A). Der LV zeigte nach einer Perfusion von 0 h Lagerung eine stärkere muskuläre Kontraktion und Entspannung als der RV (Abbildung 2C und Abbildung 3B,C). Nach 8 h Kühllagerung zeigten jedoch sowohl der LV als auch der RV eine signifikante funktionelle Reduktion im Vergleich zu einem Ausgangswert von 0 h (Abbildung 2A-D und Abbildung 3B,C). Die Abnahme der kardialen Kontraktion war in der LV stärker. Nach 8 h Lagerung betrug die Kontraktion und Relaxation des LV 25,1 % und 30,7 % des Ausgangswerts von 0 h, während der RV 32,5 % und 29,1 % der Funktion im Vergleich zum Ausgangswert von 0 h aufwies (Abbildung 3B, C). Diese Ergebnisse zeigten, dass die PID der LV nach längerer Lagerung eine signifikantere kardiale Kontraktionsreduktion aufwies als die RV. Abbildung 1: Montage und Kanülierung des Mausherzens . (A) Gesamtaufbau des Perfusionsaufbaus. 1. Perfusionsreservoir. 2. Sauerstoffversorgungskammer. 3. Luftfilter-Kammer. 4. Herzkammer. 5. Wertschalter für konstanten Durchfluss und Druck. 6 und 7. Sauerstoffzufuhr. (B) Kanülierte Herzen mit dem RV im Vordergrund. (C) Position des zu schneidenden Wohnmobils zum Öffnen seines Hohlraums. (D) Klopfen Sie mit der Kanüle auf den Ballonschlauch. Abkürzung: RV = rechter Ventrikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Vergleich der Funktion des LV im Vergleich zum RV. (A) Aufzeichnung der maximalen und minimalen dP/dt im RV und LV im Spenderherzen mit einer Lagerung von 0 h. (B) Die Aufzeichnung von max und min dP/dt im RV und LV im Spenderherzen mit 8 h Speicherdauer. (C,D) Details zu dP/dt, LV-Druck, Herzfrequenz und Perfusionsdruck im LV und RV bei 0 h und 8 h. Abkürzungen: RV = rechter Ventrikel; LV = linker Ventrikel; dP/dt = Druck-Zeit-Beziehung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Vergleich der Funktion des LV im Vergleich zum RV nach Lagerung und Perfusion. (A) Systolischer und diastolischer Druck des LV und RV nach 0 h und 8 h Lagerung. (B) Max. dP/dt und (C) Min dP/dt des LV und RV nach Perfusion mit 0 h und 8 h Lagerung. Diese Abbildung stammt von Lei et al.12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die retrograde Perfusionsmethode nach Langendorff mittels Aortenkanülierung. Diese Technik kann verwendet werden, um die LV- und RV-Funktion von murinen Herzen nach der Kühllagerung zu bewerten. Die Ergebnisse zeigen, dass die verlängerte Kühllagerung von Spenderherzen unter Verwendung dieses Protokolls zu einer reduzierten Herzfunktion sowohl im LV als auch im RV führt.

Die Studien zur akuten und chronischen Abstoßungsreaktion nach Herztransplantation konzentrieren sich weitgehend auf die Immunbiologie14. Die Auswirkungen nativer Zellen auf die PID während der Kühllagerung sind weniger gut untersucht. Die PID tritt bei ~10%-20% der Herztransplantationen auf und ist für 66% der frühen Todesfälle innerhalb von 30 Tagen nach der Transplantation verantwortlich. Insbesondere unterscheidet sich die Inzidenz von PID, die den LV im Vergleich zum RV betrifft, nach der Transplantation11. Ohne den Beitrag von Empfängerzellantworten konzentriert sich diese ex vivo Methode auf die Beiträge nativer Herzzellen zur PID nach Kältekonservierung von Spenderherzen. Weitere Studien könnten Empfängerreaktionen in ein murines Herztransplantationsmodell einbeziehen.

In diesem Protokoll konzentrierte sich die Langendorff-Perfusion von kalt konservierten Spenderherzen auf die nativen kardialen Reaktionen auf eine warme kristalloide Perfusion, ohne die zelluläre Immunität zu infiltrieren. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, wurden mehrere kritische Schritte standardisiert. Die Mäuseherzen wurden mit einer HTK-Lösung arretiert und in eiskaltem HTK gelagert, ähnlich wie in der klinischen Praxis. Das Perfusionsvolumen und die Infusionszeit der HTK-Lösung für jedes Herz wurden mit einem Timer genau überwacht. Das Spenderherz wurde in vorgekühlten Röhrchen auf HTK-haltigem Eis in einem 4 °C warmen Raum aufbewahrt. Die Kanülierungszeit waas standardisiert auf ~3 min vor der Perfusion. All diese Schritte stellten sicher, dass die Dauer der Kältekonservierung die Hauptvariable in der Studie war.

Zu Beginn der Perfusion wurde häufig eine Periode unregelmäßiger kardialer Kontraktilität für ~20 Minuten beobachtet. Diese Gleichgewichts- und Erholungsphase wurde durch die allmähliche Erwärmung und Sauerstoffversorgung des Herzgewebes erleichtert. Nach den ersten 20 Minuten wurde eine relativ stabile Phase erwartet. Der Ballon wurde ~18 Minuten nach der anfänglichen Gleichgewichtsphase in die Ventrikelhöhle eingeführt. Wir begannen mit der Aufzeichnung der Hämodynamik, nachdem das Herz ~25 Minuten lang stabil war, nachdem der Ballon eingeführt wurde. Die Perfusion mit KH-Puffer hielt die Herzleistung für ~1,5-2 h stabil. Wir haben uns daher dafür entschieden, die Hämodynamik jeweils 20 Minuten lang in der linken und rechten Herzkammer aufzuzeichnen.

Es gibt mehrere Einschränkungen der retrograden Perfusion für die Untersuchung der PID von Herzen nach Kühllagerung. Erstens ist aufgrund der Ballongröße und des Platzmangels in jeder Ventrikelhöhle (insbesondere in der RV) das gleichzeitige Einführen von zwei Ballons sowohl in die LV als auch in die RV sehr schwierig. Daher messen wir die Funktion von RV und LV sequentiell. Es ist wichtig zu beachten, dass das interventrikuläre Septum sowohl zur links- als auch zur rechtsventrikulären Funktion erheblich beiträgt. Das Septum trägt zu ~50% der rechtsventrikulären Funktion bei, so dass eine interventrikuläre Abhängigkeit vorliegt15. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Eingriffe zur Reperfusion des murinen Herzens im Langendorff-Gerät ~3 Minuten dauern, während die chirurgische Implantation des menschlichen Herzens in das relativ warme Operationsfeld ~45 Minuten dauert. Im Vergleich dazu benötigt das murine Herz in diesem Langendorff-System weniger ischämische Zeit. Dies sollte bei der klinischen Translation berücksichtigt werden.

Da wir KH-Puffer verwendet haben, um das Herz ohne Blut zu perfundieren, kann dies auch eine geringere Effizienz bei der Sauerstoffzufuhr haben. Die Herzfunktion ist jedoch während der anfänglichen 1,5-2 h Perfusion relativ stabil und ermöglicht so zuverlässige hämodynamische Messungen. Leider gibt es derzeit keine praktikablen funktionierenden Herzperfusionsmodelle für diese kleineren murinen Herzen, und der Effekt der ventrikulären Belastung kann in diesem System nicht bewertet werden. Trotzdem ist das Perfusionssystem sehr gut reproduzierbar und weniger arbeits- und zeitintensiv als Transplantationsmodelle. Es ist auch kostengünstiger als Transplantationsstudien, was es für das Screening verschiedener therapeutischer Optionen und verschiedener molekularer Signalwege besser geeignet machen könnte. Mit Modifikationen an Konservierungslösungen durch Hinzufügen von Wirkstoffkandidaten kann diese Plattform verwendet werden, um die Auswirkungen pharmakologischer Wirkstoffe auf die Reduzierung der PID sowohl bei LV als auch bei RV zu bewerten.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nichts.

Materials

4-0 silk suture Braintree Scientific SUTS108
6-0 Silk suture Braintree Scientific SUTS104
All purpose flour Kroger
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G Fisher scientific 14-826-5A
BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) Fisher scientific 14-823-16E
Corn Syrup Kroger
Custodiol HTK Solution Essential Pharmaceuticals LLC
Dissecting Scissors  World Precision Instruments 14393/14394
Falcon 50 mL conical tubes Fisher scientific 14-959-49A
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa   Sigma H4784
Krebs Henseleit buffer Sigma K3753
Nusil silicone dispersions Avantor
Perfusion system Radnoti 130101BEZ
PowerLab ADInstruments PL3508
Sodium azide Sigma S2002
Sodium bicarbonate  Sigma S5761
Sucrose Sigma S0389
Sucrose Sigma S0389
Xylazine Sigma X1126
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References

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Noly, P., Huang, W., Naik, S., Tang, P., Lei, I. Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model. J. Vis. Exp. (190), e64384, doi:10.3791/64384 (2022).
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