Summary

Bepaling van in vitro en cellulaire inschakelkinetiek voor fluorogene RNA-aptameren

Published: August 09, 2022
doi:

Summary

Het protocol presenteert twee methoden om de kinetiek van de fluorogene RNA-aptameren Spinazie2 en Broccoli te bepalen. De eerste methode beschrijft hoe fluorogene aptamerkinetiek in vitro kan worden gemeten met een platenlezer, terwijl de tweede methode de meting van fluorogene aptamerkinetiek in cellen door flowcytometrie beschrijft.

Abstract

Fluorogene RNA-aptameren zijn toegepast in levende cellen om RNA’s te taggen en te visualiseren, te rapporteren over genexpressie en fluorescerende biosensoren te activeren die niveaus van metabolieten en signaalmoleculen detecteren. Om dynamische veranderingen in elk van deze systemen te bestuderen, is het wenselijk om real-time metingen te verkrijgen, maar de nauwkeurigheid van de metingen hangt af van het feit of de kinetiek van de fluorogene reactie sneller is dan de bemonsteringsfrequentie. Hier beschrijven we methoden om de in vitro en cellulaire turn-on kinetiek voor fluorogene RNA-aptameren te bepalen met behulp van een platenlezer uitgerust met respectievelijk een monsterinjector en een flowcytometer. We tonen aan dat de in vitro kinetiek voor de fluorescentieactivering van de Spinazie2- en Broccoli-aptameren kan worden gemodelleerd als tweefasige associatiereacties en verschillende snelle fasesnelheidsconstanten heeft van respectievelijk 0,56 s−1 en 0,35 s−1. Bovendien tonen we aan dat de cellulaire kinetiek voor de fluorescentieactivering van Spinazie2 in Escherichia coli, die verder wordt beperkt door kleurstofdiffusie in de Gram-negatieve bacteriën, nog steeds voldoende snel is om een nauwkeurige bemonsteringsfrequentie op de minuuttijdschaal mogelijk te maken. Deze methoden om fluorescentieactiveringskinetiek te analyseren zijn van toepassing op andere fluorogene RNA-aptameren die zijn ontwikkeld.

Introduction

Fluorogene reacties zijn chemische reacties die een fluorescentiesignaal genereren. Fluorogene RNA-aptameren vervullen deze functie meestal door een kleine molecuulkleurstof te binden om de fluorescentie-kwantumopbrengst te verbeteren (figuur 1A)1. Verschillende fluorogene RNA aptamer systemen zijn ontwikkeld en bestaan uit specifieke RNA aptamer sequenties en de bijbehorende kleurstof liganden1. Fluorogene RNA-aptameren zijn toegevoegd aan RNA-transcripten als fluorescerende tags die live cell imaging van mRNA’s en niet-coderende RNA’smogelijk maken 2,3,4. Ze zijn ook geplaatst na promotorsequenties als fluorescerende melders van genexpressie, vergelijkbaar met het gebruik van groen fluorescerend eiwit (GFP) als verslaggever, behalve dat de rapportagefunctie zich op het RNA-niveau 5,6 bevindt. Ten slotte zijn fluorogene RNA-aptameren opgenomen in op RNA gebaseerde fluorescerende biosensoren, die zijn ontworpen om de fluorogene reactie te activeren als reactie op een specifiek klein molecuul. RNA-gebaseerde fluorescerende biosensoren zijn ontwikkeld voor live cell imaging van verschillende niet-fluorescerende metabolieten en signaalmoleculen 7,8,9,10,11.

Er is een groeiende belangstelling voor de ontwikkeling van fluorogene RNA-aptameren om dynamische veranderingen in RNA-lokalisatie, genexpressie en kleine molecuulsignalen te visualiseren. Voor elk van deze toepassingen is het wenselijk om real-time metingen te verkrijgen, maar de nauwkeurigheid van de metingen hangt af van het feit of de kinetiek van de fluorogene reactie sneller is dan de bemonsteringsfrequentie. Hier beschrijven we methoden om de in vitro kinetiek voor fluorogene RNA-aptameren Spinazie212 en Broccoli13 te bepalen met behulp van een platenlezer uitgerust met een monsterinjector en om de cellulaire turn-on kinetiek voor Spinazie2 uitgedrukt in Escherichia coli te bepalen met behulp van een flowcytometer. Deze twee RNA-aptameren werden gekozen omdat ze zijn toegepast om RNA-lokalisatie te bestuderen 2,3,4, ze zijn gebruikt in reporters 5,6 en biosensoren 7,8,9,10,11, en de overeenkomstige kleurstofliganden (DFHBI of DFHBI-1T) zijn in de handel verkrijgbaar. Een samenvatting van hun in vitro eigenschappen bepaald in de literatuur is opgenomen in tabel 1 4,13,14, die ten grondslag lag aan de ontwikkeling van het protocol (bv. de gebruikte golflengten en kleurstofconcentraties). Deze resultaten tonen aan dat de fluorogene reacties die worden beïnvloed door RNA-aptameren snel zijn en nauwkeurige metingen voor de gewenste celbiologische toepassingen niet mogen belemmeren.

Protocol

1. In vitro kinetisch experiment Voorbereiding van DNA-sjablonen door PCRPCR-reactie(s) instellen: Om PCR-reacties voor te bereiden, combineert u de volgende reagentia in een dunwandige PCR-buis:33 μL dubbel gedestilleerd water (ddH2O)10 μL 5x buffer voor high-fidelity DNA polymerase5 μL van 2 mM per desoxyribonucleosidetrifosfaat (dNTP)0,5 μL van 40 μM voorwaartse primer0,5 μL omgekeerde primer van 40 μM0,5 μL (10-100 ng) DNA-sjabloon…

Representative Results

In vitro kinetiekDe sequenties van de DNA-sjablonen en primers, die worden gekocht als synthetische oligonucleotiden, zijn weergegeven in tabel 2 en de reagensrecepten worden weergegeven in aanvullend bestand 1. PCR-amplificatie wordt gebruikt om de hoeveelheid DNA-sjabloon op te schalen met de T7-promotor, die nodig is voor de daaropvolgende in vitro transcriptie (IVT) -reactie. Bovendien kan PCR-amplificatie voor twee doeleinden i…

Discussion

Voor het in vitro kinetische experiment kan hetzelfde algemene protocol worden gewijzigd om de in vitro kinetiek te meten van een op RNA gebaseerde fluorescerende biosensor die zowel een ligandbindend als fluorofoorbindend domein bevat8. In dit geval moet het RNA worden geïncubeerd met de fluorofoor voorafgaand aan metingen bij het injecteren van het ligand om ligandresponskinetiek te verkrijgen. Als er een hoge variabiliteit wordt waargenomen tussen de replicaties, kan men prob…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan MCH: NSF-BSF 1815508 en NIH R01 GM124589. MRM werd gedeeltelijk ondersteund door opleidingsbeurs NIH T32 GM122740.

Materials

Agarose Thermo Fischer Scientific BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment Thermo Fischer Scientific B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate Thermo Fischer Scientific 18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific 22431021
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Attune NxT Flow cytometer Thermo Fischer Scientific A24861
Attune 1x Focusing Fluid Thermo Fischer Scientific A24904
Attune Shutdown Solution Thermo Fischer Scientific A24975
Attune Performance Tracking Beads Thermo Fischer Scientific 4449754
Attune Wash Solution Thermo Fischer Scientific  J24974
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C3416
Chlorine Bleach Amazon B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate Daigger Scientific EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap Globe Scientific 05-402-31
DFHBI Sigma-Aldrich SML1627
DFHBI-1T Sigma-Aldrich SML2697
D-Glucose (anhydrous) Acros Organics AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
DNA loading dye New England Biolabs B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL) Eppendorf 22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP New England Biolabs N0446S
EDTA, pH 8.0 Gibco, Life Technologies AM9260G
Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich E7023
Filter-tip micropipettor tips Thermo Fischer Scientific AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software BD Biosciences N/A FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control VWR 10014-924
Gel electrophoresis power supply Thermo Fischer Scientific EC3000XL2
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Glycogen AM95010 Thermo Fischer Scientific AM95010
GraphPad Prism Dotmatics N/A Analysis software from Academic Group License 
Heat block  Thomas Scientific 1159Z11
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Inorganic pyrophosphatase Sigma-Aldrich I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670
Magnesium sulfate (MgSO4) Fisher Scientific MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Microcentrifuge with temperature control Marshall Scientific EP-5415R
Micropipettors Gilson FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips Sigma-Aldrich Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit Sigma-Aldrich CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips DOT Scientific RN005R-LRS
PBS, 10x Thermo Fischer Scientific BP39920
PCR clean-up kit Qiagen 28181
PCR primers and templates Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes Bio-Rad 1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes Techne 5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid Addgene Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase  New England Biolabs M0530L Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific C.B.S. Scientific VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment C.B.S. Scientific ASG-250
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Razor blades Genesee Scientific 38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP New England Biolabs N0450L
SDS Sigma-Aldrich L3771
Short wave UV light source Thermo Fischer Scientific 11758221
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Thermo Fischer Scientific S375-500
SoftMax Pro Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units Thermo Fischer Scientific 09-741-88
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SYBR Safe DNA gel stain Thermo Fischer Scientific S33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresis Thermo Fischer Scientific AM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich TRIS-RO
Tryptone (granulated) Thermo Fischer Scientific M0251S
T7 RNA polymerase New England Biolabs M0251S
Urea-PAGE Gel system  National Diagnostics EC-833
UV fluorescent TLC plate Sigma-Aldrich 1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-8000-GL
Vortex mixer Thermo Fischer Scientific 2215415
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
Yeast Extract (Granulated) Thermo Fischer Scientific BP9727-2

References

  1. Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
  2. Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
  3. Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
  4. Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
  5. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  6. You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
  7. Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
  8. Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
  9. Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
  10. Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
  11. Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
  12. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  13. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  14. Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
  15. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
  16. Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
  17. Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
  18. Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
  19. Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
  20. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  21. Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
  22. Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
  23. Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
  24. Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
  25. Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).

Play Video

Cite This Article
Mumbleau, M. M., Meyer, M. R., Hammond, M. C. Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers. J. Vis. Exp. (186), e64367, doi:10.3791/64367 (2022).

View Video