Summary

İnsan Mikroglia Benzeri Hücreler: İnsan Sinaptozomları Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden ve In Vitro Canlı Hücre Fagositoz Analizinden Farklılaşma

Published: August 18, 2022
doi:

Summary

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC’ler) in vitro deney için mikroglia benzeri hücrelere farklılaşma sürecini açıklar. Ayrıca, canlı hücre görüntüleme sistemlerini kullanarak in vitro fagositoz testleri için bir substrat olarak kullanılabilecek iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan insan sinaptozomları üretmek için ayrıntılı bir prosedür de sunuyoruz.

Abstract

Mikroglia, beyin mikro ortamında homeostazı koruyan ve çoklu nörolojik hastalıklarda kilit bir oyuncu haline gelen miyeloid kökenli yerleşik bağışıklık hücreleridir. İnsan mikrogliasını sağlık ve hastalıkta incelemek, insan hücrelerinin son derece sınırlı arzı nedeniyle bir meydan okumayı temsil eder. İnsan bireylerden türetilen indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC’ler) bu bariyeri aşmak için kullanılabilir. Burada, in vitro deneyler için insan iPSC’lerinin mikroglia benzeri hücrelere (iMG’ler) nasıl ayırt edileceği gösterilmiştir. Bu iMG’ler, mikroglia benzeri morfoloji, uygun belirteçlerin ekspresyonu ve aktif fagositoz dahil olmak üzere mikroglia’nın beklenen ve fizyolojik özelliklerini sergiler. Ek olarak, insan iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan (i3LMN’ler) türetilen sinaptozom substratlarının izole edilmesi ve etiketlenmesi için belgeler sağlanmaktadır. Canlı hücreli, uzunlamasına bir görüntüleme testi, pH’a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş insan sinaptozomlarının yutulmasını izlemek için kullanılır ve iMG’nin fagositik kapasitesinin araştırılmasına izin verir. Burada açıklanan protokoller, insan mikroglia biyolojisini ve mikroglia’nın hastalığa katkısını araştıran farklı alanlara geniş ölçüde uygulanabilir.

Introduction

Mikroglia, merkezi sinir sistemindeki (CNS) yerleşik bağışıklık hücreleridir ve CNS’nin geliştirilmesinde çok önemli bir rol oynar. Mikroglia, yetişkin beyninde homeostazı korumak ve travma ve hastalık süreçlerine aktif olarak yanıt vermek için de önemlidir. Kümülatif kanıtlar, mikroglia’nın çoklu nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde anahtar katkıda bulunduğunu göstermektedir 1,2. Mikroglial biyoloji hakkındaki mevcut bilgiler ağırlıklı olarak fare modellerinden türetilmiş olsa da, son çalışmalar murin ve insan mikrogliası arasındaki önemli farklılıkları aydınlatmış ve insan mikrogliasının genetiğini ve biyolojik işlevlerini incelemek için teknolojilerin geliştirilmesine duyulan ihtiyacı vurgulamıştır 3,4. Mikroglia’nın disseke edilmiş birincil dokudan izole edilmesi, mikroglia özelliklerini ciddi şekilde değiştirebilir5, bu tür hücrelerle elde edilen potansiyel olarak kafa karıştırıcı sonuçlar. Bu yöntemin genel amacı, insan iPSC’lerini iMG’lere ayırt etmek, böylece bazal koşullar altında insan mikrogliasını incelemek için bir hücre kültürü sistemi sağlamaktır. Ayrıca, tamamen insan model sistemi kullanan bir fagositoz testi, hem kalite kontrol önlemi olarak hem de hastalık bağlamında iMG disfonksiyonunu değerlendirmek için iMG’lerin işlevselliğini incelemek için bir araç olarak buraya dahil edilmiştir.

Mikroglia’nın iPSC’lerden farklılaşması için çoklu protokoller son zamanlarda literatürdeortaya çıkmıştır 6,7,8,9,10. Bazı protokollerin potansiyel dezavantajları arasında uzun veya uzun süreli farklılaşma, çoklu büyüme faktörlerinin eklenmesi ve / veya karmaşık deneysel prosedürler 6,9,10 bulunmaktadır. Burada, iPSC’lerin ilkel makrofaj öncülleri (PMP’ler) olarak adlandırılan öncü hücrelere farklılaştırılması yoluyla mikroglia ontojenisinin yönlerini özetleyen “kullanıcı dostu” bir farklılaşma yöntemi gösterilmiştir7,11. PMP’ler daha önce açıklandığı gibi oluşturulur ve bazı optimizasyonlar burada12’de sunulmuştur. PMP’ler, kan-beyin bariyeri kapanmadan önce beyni istila ederek embriyonik gelişim sırasında mikrogliaya yol açan MYB’den bağımsız yumurta sarısı kesesi kaynaklı makrofajları taklit eder13. PMP’leri iMG’lere ölümcül bir şekilde ayırt etmek için, Haenseler ve ark. ve Brownjohn ve ark. tarafından protokollere dayanan hızlı ve basitleştirilmiş bir monokültür yöntemi kullandık ve iMG’lerin mikroglia ile zenginleştirilmiş belirteçleri 7,8 sağlam bir şekilde eksprese ettiği verimli bir mikroglia farklılaşma yöntemi oluşturmak için bazı değişiklikler yaptık. Bu farklılaştırma yöntemi, iPSC’lerin kültüründe uzmanlığa sahip laboratuvarlarda ve bir insan modeli sistemi kullanarak mikroglia biyolojisini incelemeyi amaçlayan araştırma hedefleriyle çoğaltılabilir.

iPSC türevi mikroglia, in vitro deneyler için biyolojik olarak ilgili bir insan mikroglia kaynağını temsil eder ve fagositoz da dahil olmak üzere mikroglial kanonik fonksiyonları araştırmak için önemli bir araçtır. Mikroglia, hücre kalıntılarını, toplanmış proteinleri ve bozulmuş miyelin14’ü temizledikleri beyin ve CNS’nin profesyonel fagositleridir. Mikroglia ayrıca sinapsları yutarak sinaptik yeniden şekillenmede ve patojenlerin fagositozu yoluyla dış enfeksiyonlara karşı savunmada işlev görür15,16. Bu protokolde, iMG’ler tarafından fagositoz, iMG yutulması için materyal olarak insan sinaptozomları kullanılarak değerlendirilir. Bu amaçla, insan i3LMN’lerinden türetilen sinaptozomları izole etmek için bir açıklama açıklanmaktadır. i3LMN türevi insan sinaptozomları, fagozom işleme ve in vitro bozunma sırasında asidik bölmeler içinde lokalize sinaptozomların miktarının belirlenmesine izin veren pH’a duyarlı bir boya ile etiketlenmiştir. Canlı hücre mikroskobu kullanan bir fagositoz testi, mikroglia yutulmasının dinamik sürecini gerçek zamanlı olarak izlemek için gösterilmiştir. Bu fonksiyonel tahlil, tam bir insan sistemi kullanarak sağlık ve hastalıkta mikroglial fagositozdaki olası kusurları araştırmak için bir temel oluşturur.

Protocol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler steril olmalı ve tüm adımlar steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Tüm iPSC hatlarının yanı sıra bakım ve farklılaştırma ortamları Malzeme Tablosunda açıklanmıştır. Aşağıda gösterilen mikroglia farklılaştırma yöntemi, burada açıklanan yeni değişikliklerle daha önce yayınlanmışprotokoller 7,8,12’ye<…

Representative Results

Bu protokolü kullanarak iMG’ler oluşturmak için, iyi tanımlanmış kenarlara sahip kompakt koloni morfolojisi gösteren farklılaşmamış iPSC’lerle başlamak önemlidir (Şekil 2A). EB oluşum bölümünde açıklandığı gibi tutulan ayrışmış iPSC’ler, farklılaşmanın 4. gününe kadar boyut olarak büyüyecek olan EB’ler olarak adlandırılan küresel agregalar oluşturacaktır (Şekil 2B). EB’ler PMP üretimi için uygun koşullarda toplandıktan…

Discussion

Burada açıklanan farklılaşma protokolü, iPSC türevli mikroglia benzeri hücreleri ~ 6-8 hafta içinde yüksek saflıkta ve immünofloresan deneyleri ve daha fazla sayıda hücre gerektiren diğer tahlilleri gerçekleştirmek için yeterli verimde elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. Bu protokol, 1 haftada 1 × 106 iMG’ye kadar verim vermiştir, bu da protein ve RNA ekstraksiyonuna ve karşılık gelen aşağı akış analizlerine (örneğin, RNASeq, qRT-PCR, batı lekesi, kütle spektrometrisi) i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, motor nöron farklılaşması için WTC11 hNIL iPSC hattını sağladığı için Michael Ward’a ve mikroglia farklılaşması için kullanılan KOLF2.1J WT klonu B03 iPSC hattını tedarik ettiği için Jackson Laboratuvarlarına teşekkür eder. Ayrıca, protokollerin uygulanması sırasındaki desteği için Dorothy Schafer’e, canlı hücre görüntüleme sistemine yardımları için Anthony Giampetruzzi ve John Landers’a, revizyonlar sırasındaki teknik katkıları için Hayden Gadd’e ve bu çalışmadaki işbirliği için Jonathan Jung’a teşekkür ederiz. Bu çalışma, UMASS Chan Tıp Fakültesi’nden Dan ve Diane Riccio Sinirbilim Fonu ve Angel Fund, Inc. tarafından desteklenmiştir.

Materials

Antibodies for immunofluorescence analysis
anti-IBA1 rabbit antibody Wako Chemical USA NC9288364 1:350 dilution
anti-P2RY12 rabbit antibody Sigma-Aldrich HPA014518 1:50 dilution
anti-TMEM119 rabbit antibody Sigma-Aldrich HPA051870 1:100 dilution
Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibody Abcam ab6046 1:500 dilution
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody Abclonal A6344 1:1,000 dilution
anti-PSD95 mouse antibody Millipore MAB1596 1:500 dilution
Borate buffer components
Boric acid (100 mM) Sigma B6768
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (75 mM) Sigma  S7653
Sodium tetraborate (25 mM) Sigma 221732
Cell culture materials
6-well plates Greiner Bio-One 657160
40 μm Cell Strainers  Falcon 352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated CELLTREAT 229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile CELLTREAT 229305
low adherence round-bottom 96-well plate Corning 7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate Corning 353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate Corning 353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate Corning 353872
Cell dissociation reagents
Accutase  Corning 25058CI dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation
TrypLE reagent Life Technologies 12-605-010 dissociation reagents used for microglia differentiation
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning™ 354230 Referred as to extracellular matrix coating reagent
CellAdhere Laminin-521 STEMCELL Technology 77004 Referred as to laminin 521
Poly-D-Lysine Sigma P7405 Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer
Poly-L-Ornithine Sigma  P3655 Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer
Components of iPSC media
 mTeSR Plus Kit STEMCELL Technology 100-0276 To prepare iPSC media mixed the components to 1x
Components of EB media
BMP-4 Fisher Scientific PHC9534 final concentration 50 ng/mL
iPSC media final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632 Fisher Scientific BD 562822 final concentration 10 µM
SCF PeproTech 300-07 final concentration 20 ng/mL
VEGF PeproTech 100-20A final concentration 50 ng/mL
Components of PMP base media
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122 final concentration 100 U/mL
X-VIVO 15 Lonza 12001-988 final concentration 1x
Components of PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanol Gibco 21985023 final concentration 55 µM
IL-3 PeproTech 200-03 final concentration 25 ng/mL
M-CSF PeproTech 300-25 final concentration 100 ng/mL
PMP base media final concentration 1x
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010 final concentration 1x
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122 final concentration 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol Gibco 21985023 final concentration 55 µM
IL-34 PeproTech or Biologend 200-34 or 577904 final concentration 100 ng/mL
iMG base media final concentration 1x
M-CSF PeproTech 300-25 final concentration 5 ng/mL
TGF-β PeproTech 100-21 final concentration 50 ng/mL
Components of Induction base media
DMEM/F12 with HEPES Gibco 11330032 final concentration 1x
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x Gibco 11140050 final concentration 1x
Components of Complete induction media
Compound E Calbiochem 565790 final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO
Doxycycline Sigma D9891 final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS
Induction base media final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632 Fisher Scientific BD 562822 final concentration 10 μM
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture System Gibco A3653401 final concentration 1x for media and suplemment
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x Gibco 11140050 final concentration 1x
iPSC lines used in this study
KOLF2.1J: WT clone B03 The Jackson Laboratories
WTC11 hNIL National Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific Pierce 23227
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 87793 Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent Invitrogen  R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester ThermoFisher Scientific  P36600 Referred as to pH-sensitive dye
Other cell-culture reagents
Trypan Blue, 0.4% Solution AMRESCO INC K940-100ML
Bovine serum albumin (BSA) Sigma 22144-77-0
BrdU Sigma B9285 Reconstitute to 40 mM in sterile water
Cytochalasin D Sigma final concentration 10 µM
DPBS with Calcium and magnesium Corning 21-030-CV
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV Referred as to DPBS
KnockOut  DMEM/F-12 Gibco 12660012 Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells
Laminin Mouse Protein, Natural Gibco 23017015 Referred as to laminin
Software and Equipment
Centrifuge Eppendorf Model 5810R
Cytation 5 live cell imaging reader Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software Biotek version 3.03
Multi-Therm Heat-Shake Benchmark refer as tube shaker
Water sonicator Elma Mode Transsonic 310

References

  1. Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
  2. Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
  3. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  4. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  5. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  6. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  7. Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
  8. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  9. McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
  10. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  11. Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
  12. Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
  13. Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
  14. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson’s disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
  15. Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
  16. Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
  17. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  18. Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
  19. Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  20. Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
  21. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).

Play Video

Cite This Article
Funes, S., Bosco, D. A. Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes. J. Vis. Exp. (186), e64323, doi:10.3791/64323 (2022).

View Video