Summary

Modifizierte Versuchsbedingungen für lärminduzierten Hörverlust bei Mäusen und Beurteilung der Hörfunktion und der Schädigung der äußeren Haarzellen

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für ein Mausmodell des lärminduzierten Hörverlusts (NIHL) vor. Um NIHL zu induzieren, haben wir ein neues und einfaches Gerät aus gewelltem Kunststoff, einem Rattenfallenkäfig und einem Lautsprecher entwickelt. Die auditorische Hirnstammantwort und die Immunfluoreszenzbildgebung wurden eingesetzt, um die Hörfunktion bzw. die Schädigung der äußeren Haarzellen zu beurteilen.

Abstract

Ein Tiermodell für lärminduzierten Hörverlust (NIHL) ist für Pathologen, Therapeuten, Pharmakologen und Hörforscher nützlich, um den Mechanismus von NIHL gründlich zu verstehen und anschließend die entsprechenden Behandlungsstrategien zu optimieren. Diese Studie zielt darauf ab, ein verbessertes Protokoll für die Entwicklung eines Mausmodells von NIHL zu erstellen. In dieser Studie wurden männliche C57BL/6J-Mäuse verwendet. Nicht anästhesierte Mäuse wurden an 5 aufeinanderfolgenden Tagen kontinuierlich für 6 h pro Tag bei lauten Geräuschen (1 und 6 kHz, gleichzeitig mit 115-125 dB SPL-A) exponiert. Die Hörfunktion wurde 1 Tag und 1 Woche nach der Lärmexposition unter Verwendung der auditorischen Hirnstammantwort (ABR) beurteilt. Nach der ABR-Messung wurden die Mäuse getötet und ihre Corti-Organe für die Immunfluoreszenzfärbung entnommen. Bei den Messungen der auditorischen Hirnstammreaktion (ABR) wurde 1 Tag nach der Lärmexposition ein signifikanter Hörverlust beobachtet. Nach 1 Woche sanken die Hörschwellen der Versuchsmäuse auf ~80 dB SPL, was immer noch ein signifikant höherer Wert war als bei den Kontrollmäusen (~40 dB SPL). Aus den Ergebnissen der Immunfluoreszenz-Bildgebung ging hervor, dass die äußeren Haarzellen (OHCs) geschädigt sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir ein NIHL-Modell mit männlichen C57BL/6J-Mäusen erstellt haben. Ein neues und einfaches Gerät zur Erzeugung und Wiedergabe von Reintongeräuschen wurde entwickelt und anschließend eingesetzt. Quantitative Messungen der Hörschwellen und die morphologische Bestätigung der OHC-Schädigung zeigten, dass der angewendete Lärm erfolgreich einen erwarteten Hörverlust induzierte.

Introduction

Weltweit leiden etwa 1,3 Milliarden Menschen an Hörverlust aufgrund von Lärmbelastung1. In dieser Studie haben wir uns zum Ziel gesetzt, einen klaren Schritt-für-Schritt-Prozess zur Induktion und Bestätigung von lärminduziertem Hörverlust (NIHL) zu etablieren. NIHL resultiert aus einer Degeneration/Zerstörung der Haarzellen (HCs) und Spiralganglienneuronen (SGNs), einer Schädigung der HC-Stereozilien und/oder dem Verlust von Synapsen zwischen den inneren HCs und SGNs der Cochlea. Solche Anomalien können neben NIHL auch Tinnitus und eine beeinträchtigte Sprachwahrnehmung (insbesondere in einer komplexen akustischen Umgebung) verursachen. Soziale, psychologische und kognitive Funktionen können nacheinander durch diese physiologischen Defizite beeinträchtigt werden 2,3,4,5,6.

In NIHL-bezogenen präklinischen Studien an Mäusen sind die beliebtesten Mausstämme CBA/CaJ 2,3,6,7 und C57BL/6 4,5,8. Die männlichen 3,4,7 Mäuse werden außerdem häufiger verwendet als die weiblichen, da Östrogen eine schützende Wirkung auf das Gehör hat. Daher haben wir in dieser Studie nur männliche Mäuse verwendet9. Nach Bezugnahme auf die Literatur wählten wir 1 kHz und 6 kHz als Frequenzen des angelegten Rauschens. Die Intensität des angelegten Lärms betrug 115 dB SPL-A (um den Käfig herum) bis 125 dB SPL-A (in der Mitte des Käfigs). Nachdem die Versuchsmäuse an 5 aufeinanderfolgenden Tagen kontinuierlich 6 Stunden pro Tag dem Lärm ausgesetzt wurden, deutete ein optimaler Anstieg der Hörschwelle darauf hin, dass bei den Versuchsmäusen ein optimales Ausmaß an NIHL erzeugt wurde. Die Vorgänge für den Umgang mit den Tieren, den Aufbau des Versuchsaufbaus und die Geräuscherzeugung sind im mitgelieferten Protokoll Schritt für Schritt klar beschrieben.

Protocol

Die Tierversuche in dieser Studie wurden vom Animal Care Committee des Mackay Medical College genehmigt. Acht Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden vom National Laboratory Animal Center (New Taipei City, Taiwan) gekauft. Alle Mäuse wurden nach dem Standard-Tierprotokoll gezüchtet und untergebracht. 1. Induktion von NIHL bei Mäusen Bereiten Sie den Käfig für die Versuchsmäuse vorVerwenden Sie dazu einen Rattenfangkäfig mit den Maßen 14 cm × 17…

Representative Results

Eine Verschiebung der ABR-HörschwelleDie Hörschwelle der Mäuse wurde entweder 1 Tag oder 1 Woche nach der Lärmexposition mittels Ton-Burst-ABR gemessen. Bei allen drei getesteten Frequenzen wurde 1 Tag nach der Lärmexposition (d.h. am 6. Tag) ein signifikanter Anstieg der Hörschwelle bei allen drei getesteten Frequenzen beobachtet (12 kHz: 84,29 ± 2,77 dB SPL; 24 kHz: 91,43 ± 0,92 dB SPL; 32 kHz: 98,57 ± 1,43 dB SPL). 1 Woche nach der Lärmexposition (d.h. am 13. Tag) k…

Discussion

Die NIHL kann in zwei Arten unterteilt werden: die temporäre NIHL, die eine zeitliche Verschiebung der Hörschwelle zeigt, und die permanente NIHL, die durch eine permanente Verschiebung der Hörschwelle gekennzeichnet ist. Es wird angenommen, dass der Hörverlust, den wir am 6. Tag (1 Tag nach der Lärmexposition) beobachtet haben, eine Kombination dieser beiden Arten ist. In diesem Fall würde sich die Hörschwelle aufgrund der zeitlichen Komponente des Hörverlusts im Laufe der Zeit allmählich erholen. In…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Zuschüssen des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (MOST) der taiwanesischen Regierung (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) und den internen Forschungszuschüssen des Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).

Materials

 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set GRAS 428158 For noise exposure
Amplifier Input Module, AMI100D BIOPAC For auditory brainstem response
Bio-amplifier, BIO100C BIOPAC For auditory brainstem response
Bovine Serum Albumin SIGMA A9647 Immunofluorescence staining
Cellsens software Olympus life science Image acquisition
Corrugated plastic
DAPI fluoromount SouthernBiotech 0100-20 Immunofluorescence staining
Ethylenediaminetetraacetic acid SIGMA E5134 Decalcification
Evoked Response Amplifier, ERS100C BIOPAC For auditory brainstem response
Formaldehyde APLHA F030410 Fixation of cochlear
High Performance Data Acquisition System, MP160 BIOPAC For auditory brainstem response
Modular Extension Cable, MEC110C BIOPAC For auditory brainstem response
Myo7A primary antibody Proteus 25-6790 Immunofluorescence staining
Myo7A secondary antibody Jackson immunoresearch 711-545-152 Immunofluorescence staining
Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 BIOPAC For auditory brainstem response
phalloidin antibody Alexa Fluor A12381 Immunofluorescence staining
phosphate-buffered saline SIGMA P4417
Rat trap cage 14 cm x 17 cm x 24cm
ROMPUN- xylazine injection, solution  Bayer HealthCare, LLC
Sound amplifier, MT-1000 unika For noise exposure
Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 CLIO 620300719 For noise exposure
Soundproof chamber IEA Electro-Acoustic Technology For noise exposure and ABR
Speaker  IEA Electro-Acoustic Technology For noise exposure
Stimulator Module, STM100C BIOPAC For auditory brainstem response
Triton X-100 SIGMA T8787 Immunofluorescence staining
Tubephone Set, OUT101 BIOPAC For auditory brainstem response
Upright Microscope, BX53 Olympus Image acquisition
Zoletil Virbac

References

  1. World Report on Hearing. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021)
  2. Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. 神经科学. 427, 43-57 (2020).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  4. Wang, J., et al. Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice. Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).
  5. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
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  8. Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173 (2018).
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Cite This Article
Lee, D., Pan, Y., Hsu, Y. Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage. J. Vis. Exp. (192), e64286, doi:10.3791/64286 (2023).

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