Summary

Transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongo utilizando manguitos vasculares

Published: June 23, 2022
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Summary

Modelos de transplante cardíaco de camundongos representam valiosas ferramentas de pesquisa para o estudo da imunologia do transplante. O presente protocolo detalha o transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongos que envolve a colocação de manguitos na artéria carótida comum do receptor e no tronco da artéria pulmonar do doador para permitir o fluxo sanguíneo laminar.

Abstract

Modelos murinos de transplante cardíaco são frequentemente utilizados para estudar a lesão de isquemia-reperfusão, as respostas imunes inatas e adaptativas após o transplante e o impacto das terapias imunomoduladoras na rejeição do enxerto. O transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos foi descrito pela primeira vez em 1991 usando anastomoses suturadas e posteriormente modificado para incluir técnicas de manguito. Essa modificação permitiu melhores taxas de sucesso e, desde então, houve vários relatórios que propuseram melhorias técnicas adicionais. No entanto, a tradução para uma utilização mais difundida permanece limitada devido à dificuldade técnica associada às anastomoses do enxerto, que requer precisão para alcançar o comprimento e o calibre adequados dos manguitos para evitar torção anastomótica vascular ou tensão excessiva, o que pode resultar em danos ao enxerto. O presente protocolo descreve uma técnica modificada para a realização de transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos que envolve a colocação do manguito na artéria carótida comum do receptor e na artéria pulmonar do doador em alinhamento com a direção do fluxo sanguíneo.

Introduction

Abbott et al. publicaram1 a primeira descrição do transplante cardíaco abdominal heterotópico em ratos em 1964. Essas técnicas cirúrgicas foram refinadas e simplificadas por Ono et al., em 19692. Corry et al. descreveram pela primeira vez um método para transplante cardíaco abdominal heterotópico em camundongos em 1973; semelhante aos modelos de ratos relatados anteriormente, envolveu enxerto no abdome do hospedeiro com revascularização por anastomoses end-to-side da artéria pulmonar do doador e aorta ascendente para a veia cava inferior e aorta abdominal do receptor, respectivamente3. O transplante cardíaco cervical heterotópico em ratos foi descrito por Heron em 1971 com manguitos de Teflon feitos de cateteres intravenosos de 16 G (1,6 mm de diâmetro externo)4. Chen5 e Matsuura et al.6 relataram posteriormente transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos em 1991, cujas técnicas diferiam principalmente em seu método de re-anastomose. A abordagem de Chen envolveu anastomoses suturadas da aorta ascendente do doador para a artéria carótida do receptor e da artéria pulmonar do doador para a veia jugular externa do receptor5. Devido à habilidade técnica avançada necessária para essas anastomoses microcirúrgicas suturadas, uma quantidade significativa de tempo e experiência foi necessária para alcançar uma alta taxa de sucesso. Matsuura et al. descreveram um método utilizando uma técnica de manguito sem sutura, semelhante à utilizada por Heron, que envolveu anastomoses de ponta a ponta utilizando a colocação extraluminal de manguitos. Confeccionou manguitos de Teflon a partir de cateteres intravenosos de 22 G (0,8 mm de diâmetro externo) e 24 G (0,67 mm de diâmetro externo) e colocou-os sobre a veia jugular externa e a artéria carótida comum do receptor, respectivamente6. Esses manguitos foram então colocados dentro da artéria pulmonar e da aorta do doador e fixados amarrando uma ligadura de sutura ao redor da conexão. Esta abordagem traduziu-se numa melhor taxa de sucesso. Mais importante ainda, resultou em um encurtamento do tempo necessário para completar ambas as anastomoses cervicais, reduzindo assim o tempo isquêmico quente do enxerto para menos de um terço do que utiliza o método de sutura abdominal. Além disso, como os manguitos são colocados ao redor da superfície externa do vaso, não há corpo estranho exposto à luz do vaso, o que reduz em grande parte a possibilidade de trombose após a cirurgia7. Enquanto isso, a utilização da técnica do manguito fornece suporte ao redor dos vasos no local da anastomose sem a necessidade de sutura, o que reduz o risco de sangramento após a revascularização6.

Numerosas revisões desta técnica foram propostas. Para acomodar o curto comprimento da artéria carótida comum do camundongo (aproximadamente 5 mm), Tomita et al.8 desenvolveram uma modificação dessa técnica com um manguito arterial menor (0,6 mm de diâmetro externo), omitindo suturas de retenção e puxando a artéria diretamente através do manguito com pinça fina. Wang et al. simplificaram ainda mais essa abordagem, colocando manguitos 22 G e 24 G na artéria pulmonar direita do doador e na artéria carótida comum direita do receptor, respectivamente9. Vários relatos descreveram modificações nessas abordagens, incluindo o uso de manguitos especializados, grampos microcirúrgicos, dilatadores de vasos e cardioplegia10,11,12. Notavelmente, todos esses métodos envolvem a circulação retrógrada do sangue através do coração, com o sangue fluindo da artéria carótida comum receptora para a aorta doadora, as artérias coronárias, o seio coronário, esvaziando então para o átrio direito e saindo da artéria pulmonar para a veia jugular externa receptora.

Em comparação com o enxerto no abdômen, o transplante cardíaco cervical oferece múltiplas vantagens. Como mencionado anteriormente, a exposição cervical permite uma revascularização mais rápida e tempos isquêmicos quentes mais curtos6. O método cervical também é menos invasivo e está associado a menores tempos de recuperação pós-operatória, pois evita uma laparotomia6. É importante ressaltar que anastomoses de ponta a ponta com manguitos podem ser realizadas em vez de anastomoses de ponta a ponta, o que diminui o risco de complicações como sangramento anastomótico. A abordagem abdominal também representa um risco aumentado de desenvolver complicações trombóticas na aorta abdominal ou veia cava inferior, levando a isquemia da medula espinhal e paralisia dos membros posteriores. A localização cervical superficial do transplante permite fácil acesso à avaliação da viabilidade do enxerto por palpação, eletrocardiografia e imagens invasivas ou não invasivas. Embora os enxertos cervicais retomem a atividade cardíaca espontânea após a reperfusão, eles não afetam significativamente os parâmetros sistólicos e diastólicos do receptor. Este modelo fornece informações valiosas para o estudo das respostas celulares após o transplante, como lesão de isquemia-reperfusão e rejeição do enxerto. Além disso, este modelo oferece uma abordagem ideal para permitir imagens pós-transplante, como microscopia intravital de dois fótons ou tomografia por emissão de pósitrons (PET). Para tanto, nosso laboratório já relatou métodos de imagem de tecidos e órgãos em movimento em camundongos, incluindo batimento de corações murinos e enxertos de arco aórtico após transplante cervical heterotópico para visualizar o tráfico de leucócitos durante lesão de isquemia-reperfusão e dentro de placas ateroscleróticas, respectivamente13,14,15 . Além disso, devido à sua localização superficial e facilidade de exposição, esse modelo é adequado para o retransplante cardíaco16.

Este relato descreve uma técnica que permite o fluxo sanguíneo laminar com a colocação externa dos manguitos vasculares nos vasos de onde se origina o fluxo sanguíneo. Isso permite uma transição suave do fluxo sanguíneo de um vaso para o outro, evitando a exposição da borda do vaso distal no lúmen vascular. Além disso, a técnica utiliza um manguito maior de 20 G, em vez de manguitos de 22 G usados anteriormente, para a artéria pulmonar doadora para garantir amplo retorno do fluxo sanguíneo para o receptor.

Protocol

Todos os procedimentos de manuseio de animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do NIH Care and Use of Laboratory Animals e aprovados pelo Comitê de Estudos Animais da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Corações de camundongos C57BL/6 (B6) e BALB/c (pesando 20-25 g) foram transplantados para receptores B6 pareados por sexo (6-8 semanas de idade). Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Transplantes singênicos foram realizados para a…

Representative Results

Este modelo de transplante cardíaco heterotópico cervical de camundongos tem sido utilizado para realizar mais de 1.000 transplantes em nosso laboratório, com uma taxa de sobrevida de aproximadamente 97%. A taxa de sucesso é ligeiramente maior do que relatos anteriores utilizando outras técnicas de transplante cardíaco heterotópico cervical em camundongos10,11,20. Isso poderia ser atribuído ao manguito maior de 20 G colo…

Discussion

Utilizando esta técnica, o transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongo pode ser realizado em menos de 40 minutos por um microcirurgião experiente e em aproximadamente 60 minutos por um microcirurgião de nível básico. Embora o transplante cardíaco cervical tenha sido estudado em numerosos modelos animais, um modelo de camundongo continua sendo o padrão-ouro devido a múltiplas cepas genéticas bem definidas, capacidades de alteração genética e disponibilidade de numerosos reagentes, incluindo anti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A DK é apoiada pelos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, Veterans Administration Merit Review grant 1I01BX002730 e The Foundation for Barnes-Jewish Hospital.

Materials

6-0 braided silk ties Henry Schein Inc 7718729
0.75% Providone iosine scrub Priority Care Inc NDC 57319-327-0
10-0 nylon suture Surgical Specialties Corporation AK-0106
655-nm nontargeted Q-dots Invitrogen Q21021MP
70% Ethanol Pharmco Products Inc 111000140
8-0 braided silk ties Henry Schein Inc 1005597
Adson forceps Fine Science Tools Inc 91127-12
BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) Jackson Laboratories
Bipolar coagulator Valleylab Inc SurgII-20, E6008/E6008B
Carprofen (Rimadyl) injection Transpharm 35844
Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet Transpharm 38995/37919
Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software A&B Software
Dumont no. 5 forceps Fine Science Tools Inc 11251-20
Fine vannas style spring scissors Fine Science Tools Inc 15000-03
GraphPad Prism 5.0 Sun Microsystems Inc.
Halsey needle holder Fine Science Tools Inc 91201-13
Halsted-Mosquito clamp curved tip Fine Science Tools Inc 91309-12
Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 Harvard Apparatus MA1 55-0001
Heparin solution (100 U/mL) Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Imaris Bitplane
Ketamine (50 mg/kg) Wyeth 206205-01
Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification Leica Microsystems
Moria extra fine spring scissors Fine Science Tools Inc 15396-00
Ohio isoflurane vaporizer Parkland Scientific V3000i
Qdots ThermoFisher 1604036
S&T SuperGrip Forceps angled tip Fine Science Tools Inc 00649-11
S&T SuperGrip Forceps straight tip Fine Science Tools Inc 00632-11
Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride Hospira Inc NDC 0409-4888-20
Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) Puritan Medical Company LLC 823-WC
Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter Terumo Medical Corporation SR-OX2032CA
Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter Terumo Medical Corporation R-OX2419CA
ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) Thermocare Inc
VetBond Santa Cruz Biotechnology SC361931 NC0846393
Xylazine (10 mg/kg) Lloyd Laboratories 139-236

References

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Cite This Article
Li, W., Shepherd, H. M., Krupnick, A. S., Gelman, A. E., Lavine, K. J., Kreisel, D. Mouse Heterotopic Cervical Cardiac Transplantation Utilizing Vascular Cuffs. J. Vis. Exp. (184), e64089, doi:10.3791/64089 (2022).

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