Summary

Uma estratégia para o estudo de células linfoides produtoras de IL-9 no modelo de infecção por Nippostrongylus brasiliensis

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

As células T e ILC2 que expressam IL-9 são induzidas durante a infecção por N. brasiliensis , mas sua caracterização tem sido amplamente negligenciada no intestino infectado devido à sua baixa frequência e cinética diferencial. Este protocolo descreve o isolamento dessas células de diferentes órgãos-alvo e a confirmação de sua identidade via citometria de fluxo em diferentes estágios de infecção.

Abstract

A IL-9 é uma citocina pleiotrópica associada a vários processos, incluindo imunidade antitumoral, indução de patologias alérgicas e resposta imune contra infecções por helmintos, onde desempenha um papel importante na expulsão do parasita. Em um modelo murino de infecção por Nippostrongylus brasiliensis, a IL-9 é produzida principalmente por linfócitos T CD4+ e células linfoides inatas encontradas no pulmão, intestino delgado e linfonodos drenantes. Dadas as dificuldades técnicas envolvidas na coloração intracelular da IL-9, bem como a complexidade de isolar células hematopoiéticas do intestino delgado após a infecção, há uma necessidade premente de um protocolo abrangente, mas direto, para analisar a expressão de IL-9 em diferentes tecidos linfoides e não linfoides neste modelo. O protocolo aqui descrito descreve a cinética da IL-9 produzida pelas células T CD4+ e pelas células linfoides inatas no pulmão e intestino delgado, os principais órgãos visados pelo N. brasiliensis, bem como nos linfonodos mediastinais e mesentéricos, durante toda a infecção. Além disso, detalha o número de larvas necessárias para a infecção, dependendo do tipo de célula e órgão de interesse. Este protocolo tem como objetivo auxiliar na padronização de ensaios para economizar tempo e recursos, oferecendo a oportunidade de focar nas células, órgãos e estágios específicos da doença de interesse no modelo de infecção por N. brasiliensis.

Introduction

Os ancilostomídeos são parasitas intestinais que infectam aproximadamente 700 milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente em áreas tropicais em países subdesenvolvidos. Infecções de alta intensidade por Ancylostoma duodenale e Necator americanus, os parasitas ancilostomídeos mais comuns em humanos, causam anemia e deficiência proteica que podem resultar em atraso no crescimento e desenvolvimento mental1. N. americanus e o parasita roedor Nippostrongylus brasiliensis induzem uma resposta imune prototípica tipo 2 em seu hospedeiro e compartilham semelhanças em seu ciclo de vida. Assim, a infecção de camundongos com N. brasiliensis é o modelo mais comumente utilizado para infecções por ancilostomídeos humanos. Larvas infecciosas de N. brasiliensis em estágio 3 (L3) movem-se da pele para o pulmão nas primeiras horas pós-infecção. Uma vez no pulmão, eles se tornam L4 e migram para cima da traqueia para serem engolidos, passam pelo estômago e atingem o intestino para se tornarem adultos (L5) dentro de 4-5 dias. No intestino, os vermes L5 põem ovos que são excretados nas fezes para reiniciar o ciclo de vida do parasita2.

A resposta imune induzida por N. brasiliensis é caracterizada por um aumento em várias citocinas tipo 2, incluindo IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, juntamente com eosinofilia, basofilia, hiperplasia caliciforme e mastócitos e aumento da produção de IgG1 e IgE. A maioria dos estudos que tentam identificar e definir as respostas imunes provocadas na infecção por N. brasiliensis está centrada no papel da IL-4 ou IL-13 nesse modelo3. No entanto, a identificação e caracterização de células que expressam IL-9 e a função desta citocina foram amplamente negligenciadas, até que Licona-Limón et al. publicaram o primeiro estudo demonstrando um papel crítico para a IL-9 na resposta imune contra N. brasiliensis. Usando camundongos repórteres, este estudo descreveu as células T (principalmente o T helper 9) e as células linfoides inatas do tipo 2 (ILC2s) como os principais subconjuntos celulares que expressam IL-9 após a infecção4.

O isolamento e a caracterização de células imunes de pulmões infectados por helmintos são viáveis e têm sido amplamente relatados 3,4. No entanto, devido ao inerente remodelamento tecidual e à produção de muco, fazê-lo no intestino infectado mostrou-se um desafio técnico, até a recente publicação de Ferrer-Font et al.5. O grupo delineou um protocolo para isolar e analisar suspensões unicelulares de subconjuntos imunológicos de intestinos murinos infectados por Heligmosomoides polygyrus. Com base nisso, padronizamos agora um protocolo para isolamento e análise citométrica de células linfoides expressas de IL-9 do intestino infectado por N. brasiliensis. Além disso, estabelecemos a cinética da IL-9 a partir de diferentes fontes celulares e locais anatômicos durante toda a infecção.

Caracterizar as distintas populações celulares envolvidas nesta infecção é vital para uma compreensão mais ampla da resposta imune ao parasita e sua interação com o hospedeiro. Este protocolo abrangente fornece uma rota clara para isolar e analisar células produtoras de IL-9 dos órgãos desejados em estágios de doença de interesse, permitindo uma melhoria acentuada do conhecimento sobre o papel dessas células na infecção por N. brasiliensis e infecções parasitárias em geral.

Protocol

Todos os experimentos em animais aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Interno de Manejo Animal (CICUAL) do Instituto de Fisiologia Celular da Universidade Nacional Autônoma do México. NOTA: Um fluxograma de todo o protocolo é mostrado na Figura 1. 1. Alojamento de ratos Use grupos de camundongos de 8 a 10 semanas de idade, fêmeas ou machos, alojados em instalações para animais com temperatura e um…

Representative Results

Os camundongos foram injetados por via subcutânea com larvas de N. brasiliensis do estágio 200 L3 ou com PBS para controles simulados. O número de larvas utilizadas neste protocolo foi ajustado para isolar células viáveis dos pulmões, tecido linfoide e intestino delgado, ao contrário de relatos anteriores, onde cargas mais elevadas de vermes foram utilizadas para detectar células em tecidos linfoides e pulmões apenas4. Pulmões, linfonodos mediastinais, linfonodos mesentéricos e…

Discussion

Uma compreensão completa das interações parasita-hospedeiro intestinal e das respostas imunes à infecção por helmintos requer a identificação e análise das diferentes populações celulares e moléculas efetoras que são fundamentais para a indução da remodelação tecidual e expulsão de vermes. As infecções por helmintos transmitidas pelo solo representam um grande problema nos países em desenvolvimento em todo o mundo. No entanto, até recentemente, nãoestava disponível um proto…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a José Luis Ramos-Balderas pelo seu apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pela seguinte subvenção à PLL da CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P e EO-M receberam uma bolsa da CONACYT (736162 e 481437, respectivamente). MCM-M recebeu uma bolsa da CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

References

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Cite This Article
Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

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