Summary

Una strategia per lo studio delle cellule linfoidi produttrici di IL-9 nel modello di infezione da Nippostrongylus brasiliensis

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

Le cellule T e ILC2 che esprimono IL-9 sono indotte durante l’infezione da N. brasiliensis , ma la loro caratterizzazione è stata ampiamente trascurata nell’intestino infetto a causa della loro bassa frequenza e cinetica differenziale. Questo protocollo descrive l’isolamento di queste cellule da diversi organi bersaglio e la conferma della loro identità tramite citometria a flusso in diversi stadi di infezione.

Abstract

IL-9 è una citochina pleiotropica associata a vari processi, tra cui l’immunità antitumorale, l’induzione di patologie allergiche e la risposta immunitaria contro le infezioni da elminti, dove svolge un ruolo importante nell’espulsione del parassita. In un modello murino di infezione da Nippostrongylus brasiliensis, IL-9 è prodotta principalmente dai linfociti T CD4 + e dalle cellule linfoidi innate presenti nel polmone, nell’intestino tenue e nei linfonodi drenanti. Date le difficoltà tecniche coinvolte nella colorazione intracellulare di IL-9, così come la complessità di isolare le cellule ematopoietiche dall’intestino tenue dopo l’infezione, vi è una pressante necessità di un protocollo completo ma semplice per analizzare l’espressione di IL-9 in diversi tessuti linfoidi e non linfoidi in questo modello. Il protocollo qui descritto delinea la cinetica di IL-9 prodotta dalle cellule T CD4+ e dalle cellule linfoidi innate nel polmone e nell’intestino tenue, i principali organi bersaglio di N. brasiliensis, nonché nei linfonodi mediastinici e mesenterici, durante l’infezione. Inoltre, descrive in dettaglio il numero di larve necessarie per l’infezione, a seconda del tipo di cellula e dell’organo di interesse. Questo protocollo mira ad assistere nella standardizzazione dei saggi per risparmiare tempo e risorse offrendo l’opportunità di concentrarsi sulle cellule, gli organi e gli stadi specifici della malattia di interesse nel modello di infezione da N. brasiliensis.

Introduction

Gli anchilostomi sono parassiti intestinali che infettano circa 700 milioni di persone in tutto il mondo, soprattutto nelle aree tropicali dei paesi sottosviluppati. Le infezioni ad alta intensità da Ancylostoma duodenale e Necator americanus, i parassiti anchilostomi più comuni nell’uomo, causano anemia e carenza proteica che possono causare ritardo della crescita e dello sviluppo mentale1. N. americanus e il parassita dei roditori Nippostrongylus brasiliensis inducono una risposta immunitaria prototipica di tipo 2 nel loro ospite e condividono somiglianze nel loro ciclo vitale. Quindi, l’infezione dei topi con N. brasiliensis è il modello più comunemente usato per le infezioni da anchilostomi umani. Stadio 3 (L3) N. brasiliensis larve infettive si spostano dalla pelle al polmone nelle prime ore dopo l’infezione. Una volta nel polmone, diventano L4 e migrano lungo la trachea per essere inghiottiti, passare attraverso lo stomaco e raggiungere l’intestino per diventare adulti (L5) entro 4-5 giorni. Nell’intestino, i vermi L5 depongono le uova che vengono escrete nelle feci per riavviare il ciclo di vita del parassita2.

La risposta immunitaria indotta da N. brasiliensis è caratterizzata da un aumento di diverse citochine di tipo 2, tra cui IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, insieme a eosinofilia, basofilia, iperplasia del calice e dei mastociti e aumento della produzione di IgG1 e IgE. La maggior parte degli studi che cercano di identificare e definire le risposte immunitarie suscitate dall’infezione da N. brasiliensis sono incentrati sul ruolo di IL-4 o IL-13 in questo modello3. Tuttavia, l’identificazione e la caratterizzazione delle cellule che esprimono IL-9 e la funzione di questa citochina erano state ampiamente trascurate, fino a quando Licona-Limón et al. hanno pubblicato il primo studio che dimostrava un ruolo critico per IL-9 nella risposta immunitaria contro N. brasiliensis. Utilizzando topi reporter, questo studio ha descritto le cellule T (principalmente T helper 9) e le cellule linfoidi innate di tipo 2 (ILC2) come i principali sottogruppi cellulari che esprimono IL-9 dopo l’infezione4.

L’isolamento e la caratterizzazione di cellule immunitarie da polmoni infetti da elminti è fattibile, ed è stato ampiamente riportato 3,4. Tuttavia, a causa del rimodellamento dei tessuti intrinseco e della produzione di muco, farlo nell’intestino infetto si è rivelata una sfida tecnica, fino alla recente pubblicazione di Ferrer-Font et al.5. Il gruppo ha delineato un protocollo per isolare e analizzare sospensioni a singola cellula di sottogruppi immunitari da intestini murini infetti da Heligmosomoides polygyrus. Sulla base di esso, abbiamo ora standardizzato un protocollo per l’isolamento e l’analisi citometrica delle cellule linfoidi che esprimono IL-9 dall’intestino infetto da N. brasiliensis. Inoltre, abbiamo stabilito la cinetica di IL-9 da diverse fonti cellulari e posizioni anatomiche durante l’infezione.

Caratterizzare le distinte popolazioni cellulari coinvolte in questa infezione è vitale per una più ampia comprensione della risposta immunitaria al parassita e della sua interazione con l’ospite. Questo protocollo completo fornisce un percorso chiaro per isolare e analizzare le cellule produttrici di IL-9 dagli organi desiderati nelle fasi della malattia di interesse, consentendo un netto miglioramento delle conoscenze sul ruolo di queste cellule nell’infezione da N. brasiliensis e nelle infezioni parassitarie in generale.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali qui descritti sono stati approvati dal Comitato interno per la gestione degli animali (CICUAL) dell’Istituto di fisiologia cellulare, Università Nazionale Autonoma del Messico. NOTA: nella Figura 1 è illustrato un diagramma di flusso dell’intero protocollo. 1. Alloggiamento dei topi Utilizzare gruppi di topi di 8-10 settimane, femmine o maschi, alloggiati in strutture per …

Representative Results

I topi sono stati iniettati per via sottocutanea con 200 larve di N. brasiliensis in stadio L3 o con PBS per controlli fittizi. Il numero di larve utilizzate in questo protocollo è stato regolato al fine di isolare le cellule vitali dai polmoni, dal tessuto linfoide e dall’intestino tenue, a differenza dei rapporti precedenti in cui sono stati utilizzati carichi più elevati di vermi per rilevare le cellule nei tessuti linfoidi e nei polmoni solo4. I polmoni, i linfonodi mediastinici, i …

Discussion

Una comprensione completa delle interazioni parassita-ospite intestinale e delle risposte immunitarie all’infezione da elminti richiede l’identificazione e l’analisi delle diverse popolazioni cellulari e delle molecole effettrici che sono fondamentali per l’induzione del rimodellamento tissutale e l’espulsione dei vermi. Le infezioni da elminti trasmesse dal suolo rappresentano un grosso problema nei paesi in via di sviluppo di tutto il mondo. Tuttavia, fino a poco tempo fa, nonera disponibile un

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare José Luis Ramos-Balderas per il suo supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dalla seguente sovvenzione a PLL da parte di CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P e EO-M hanno ricevuto una borsa di studio da CONACYT (rispettivamente 736162 e 481437). MCM-M ha ricevuto una borsa di studio da CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

References

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Cite This Article
Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

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