Этот протокол подробно описывает метод рассечения жировых депо мышей и выделения и переваривания соответствующих артерий для высвобождения, а затем идентификации популяции эндотелиальных клеток. Свежеизолированные клетки, используемые в последующих приложениях, будут способствовать пониманию биологии сосудистых клеток и механизмов сосудистой дисфункции.
Сосудистые эндотелиальные клетки, выстилающие стенку сосудистой системы, играют важную роль в различных физиологических процессах, включая регуляцию тонуса сосудов, барьерные функции и ангиогенез. Дисфункция эндотелиальных клеток является отличительным предиктором и основным фактором прогрессирования тяжелых сердечно-сосудистых заболеваний, но основные механизмы остаются плохо изученными. Возможность выделения и проведения анализов эндотелиальных клеток из различных сосудистых русл в их родном виде даст представление о процессах сердечно-сосудистых заболеваний. В этом протоколе представлена процедура рассечения подкожной и брыжеечной жировой клетчатки мышей с последующей изоляцией их соответствующих артериальных сосудов. Изолированные артерии затем перевариваются с использованием определенного коктейля пищеварительных ферментов, ориентированных на высвобождение функционально жизнеспособных эндотелиальных клеток. Переваренную ткань оценивают с помощью анализа проточной цитометрии с использованием клеток CD31+/CD45− в качестве маркеров для положительной идентификации эндотелиальных клеток. Клетки могут быть отсортированы для непосредственных последующих функциональных анализов или использованы для генерации первичных клеточных линий. Метод выделения и переваривания артерий из разных сосудистых русл предоставит исследователям возможность оценить свежеизолированные сосудистые клетки из интересующих артерий и позволит им выполнять широкий спектр функциональных тестов на конкретных типах клеток.
Эндотелиальные клетки хорошо известны своей важной ролью в различных физиологических процессах, включая барьерные функции, ангиогенез и регуляцию тонуса сосудов 1,2. Хотя дисфункция эндотелиальных клеток хорошо документирована в продвижении атеросклероза, гипертонии, диабета и т. Д., Основные механизмы, приводящие к эндотелиальной дисфункции, остаются плохо изученными и, вероятно, различаются между различными сосудистыми руслами 2,3,4. Попытка разгадать эти патологические механизмы дисфункции эндотелиальных клеток оспаривается ограниченным доступом к чистой популяции эндотелиальных клеток из тканей и/или фенотипическими изменениями эндотелиальных клеток в культуре 5,6. Таким образом, возможность выделения и выполнения анализов эндотелиальных клеток из различных сосудистых русл в их родной форме даст представление о процессах сердечно-сосудистых заболеваний.
Этот протокол представляет процедуру рассечения подкожной и брыжеечной жировой клетчатки у мышей с последующим выделением их соответствующей артериальной сосудистой системы. Функционально жизнеспособные эндотелиальные клетки, выстилающие артериальные стенки, высвобождаются с помощью специфического коктейля ферментов. Особое внимание было уделено оптимизации условий протокола пищеварения для получения достаточного выхода эндотелиальных клеток из <1 мг исходной ткани при сохранении биомолекулярных маркеров нетронутыми для анализа. Изолированные эндотелиальные клетки затем идентифицируются с помощью проточной цитометрии. Присутствие CD31 (PECAM) используется в первую очередь для идентификации эндотелиальных клеток. Благодаря экспрессии CD31 в других типах клеток, включая некоторые из них кроветворного происхождения, которые также экспрессируют CD45, чистота изолированных эндотелиальных клеток была дополнительно повышена путем исключения клеток, экспрессирующих как CD31, так и CD45 5,6,7,8. Кроме того, в зависимости от исследовательского вопроса и последующих приложений, которые будут использоваться, исследователи должны рассмотреть возможность выбора обширной панели положительных и отрицательных маркеров отбора для оптимизации чистоты интересующей популяции клеток.
Хотя метод рассечения и изоляции артерий жирового депо использовался в предыдущих публикациях 9,10,11,12,13, подробный протокол, описывающий изоляцию встроенных артерий, еще не представлен. Демонстрация техники выделения и переваривания артерий из разных сосудистых русл из данного вида, представляющего интерес, предоставит исследователям возможность оценить свежеизолированные сосудистые клетки из интересующих артерий и позволит им выполнить широкий спектр функциональных тестов на конкретных типах клеток. Испытания могут включать, но не ограничиваются ими, проточную цитометрию для сортировки клеток и экспрессии мембранного белка 5,8, электрофизиологию активностиионных каналов 9, молекулярное профилирование (протеомика/геномный анализ и т.д.). 14,15, а генерация первичных клеточных линий для скрининга лекарств in vitro16,17.
Эндотелиальная дисфункция является предшественником тяжелых болезненных состояний, вероятно, приводящих к развитию атеросклероза, гипертонии и инсульта 3,23. В то время как выявленные механизмы, лежащие в основе эндотелиальной дисфункции при данном патологическом состоянии, многочисленны, различные сосудистые русла, вероятно, будут по-разному зависеть от патологических состояний 4,24. Кроме того, различные сердечно-сосудистые факторы риска (например, ожирение, гипертония, дислипидемия, курение, диабет) вызывают дисфункцию с помощью различных различных механизмов23,25. Поэтому крайне важно изолировать популяции эндотелиальных клеток из установленных животных моделей заболевания или доступных тканей человека и выполнять анализы на клетках, немедленно удаленных из среды in vivo. Выделение клеток таким образом имеет уникальное преимущество перед изучением клеток в культуре в том, что они лишены вызванных культурой фенотипических изменений 5,6. Кроме того, включая гетерогенную популяцию эндотелиальных клеток, наблюдаемую in vivo26,27 (и которая может быть дополнительно отделена с помощью сортировки клеток с помощью потока), от живого организма лучше информирует среду in vivo. Наконец, этот метод применим к исследованию многочисленных животных моделей и, возможно, тканей человека и может быть использован для генерации первичных линий клеточной культуры, если такая необходимость оправдана.
Критическим шагом в этом протоколе и шагом, который потребует наибольшей корректировки для различных сосудистых русл или типов клеток, не представленных здесь, является пищеварение сосудистой ткани. Этот шаг должен быть оптимизирован для здоровья клеток без уменьшения выхода клеток. Специфические используемые ферменты и продолжительность пищеварения имеют решающее значение для оптимизации здоровья клеток и выхода, чтобы иметь возможность адекватно выполнять последующие анализы. Для идентификации мембранной экспрессии CD36, обнаруженной с помощью проточной цитометрии в подкожных и брыжеечных эндотелиальных клетках (фиг.4), была разработана модифицированная версия протокола пищеварения, первоначально разработанная для электрофизиологии пластырного зажима28 . Это включало в себя увеличение времени переваривания коллагеназы I до 30 мин для увеличения выхода клеток для лучшего удовлетворения требований проточной цитометрии по сравнению с тем, что требуется для исследований зажима. Поскольку эта модификация может в некоторой степени влиять на здоровье клеток, пятно жизнеспособности клеток использовалось в анализах проточной цитометрии, чтобы гарантировать, что только жизнеспособные эндотелиальные клетки оценивались в соответствии с этим протоколом (рисунок 3). Рекомендуется, чтобы исследования, направленные на выделение клеток из сосудистой ткани, включали маркер жизнеспособности клеток до оценки желаемого подхода.
Описанный протокол достаточен для высвобождения жизнеспособных эндотелиальных клеток для анализа и последующего применения из артериальных образцов ≤1 мг, полученных от мышей; однако, если бы интересующие артерии были выделены из различных тканей или организмов (например, людей), что привело бы к значительному различию артериальных масс, пришлось бы оптимизировать содержание ферментов пищеварения и продолжительность инкубации, чтобы эффективно изолировать интересующую клеточную популяцию. Для некоторых сосудистых ложек, которые начинаются с еще меньшего количества исходной ткани, чем подкожное и брыжеечное русла, представленные здесь (например, коронарные артерии), может потребоваться объединение артерий нескольких мышей на образец. Действительно, это может быть необходимым шагом для любого сосудистого русла, учитывая, что подход к результату требует относительно высокого выхода клеток. Основным ограничением является то, что из-за характера вариаций на переваривание образца выходы клеток иногда могут значительно различаться в разных партиях, даже если они находятся в одном и том же сосудистом русле. Это может вызвать проблемы при анализе данных и должно быть учтено путем нормализации, когда это необходимо. Например, экспрессия CD36 была чрезвычайно изменчивой в исходных данных из-за изменений в выходе клеток в отдельных образцах подкожных и брыжеечных жировых артерий. Поэтому необработанные данные были нормализованы до средней интенсивности флуоресценции CD31+CD45− с предположением, что этот метод будет корректировать разности партий (рисунок 4). Конечно, в зависимости от подхода могут потребоваться более сложные статистические анализы и методы нормализации.
Таким образом, в этой статье представлен метод рассечения, выделения и переваривания подкожных и брыжеечных артерий мышей для исследования экспрессии и / или функции эндотелиальных мишеней, представляющих интерес. С модификациями представленного протокола могут быть исследованы различные сосудистые русла и типы клеток (например, гладкомышечные клетки). Этот протокол, как основа для множества доступных экспериментальных подходов, имеет потенциал для продвижения понимания биологии сосудистых клеток и механизмов сосудистой дисфункции.
The authors have nothing to disclose.
В память о Риче Уэсте, блестящем ученом, коллеге и дорогом друге. Мы хотели бы поблагодарить Университет Делавэра по проточной цитометрии и BioImaging Core в рамках Института биотехнологии штата Делавэр за их постоянный вклад в наши исследования. Мы также хотели бы поблагодарить Эмму Хаджинс за тщательное рецензирование и редактирование рукописи. Нашу работу поддерживает Национальный институт общих медицинских наук P20GM113125-6564 (И.С. Фанчер). Этот проект также был поддержан программой DELAWARE INBRE, с грантом NIGMS (P20GM103446) от Национальных институтов здравоохранения и штата Делавэр (I.S. Fancher) и грантом Университета Делавэра General University Research (I.S. Fancher). Этот контент является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения NIH.
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |