FACS-عزل وثقافة السلف الليفي الأديبوجينيك والخلايا الجذعية العضلية من العضلات الهيكلية للفئران غير المضطربة والمصابة
Summary
يعد التحديد الدقيق للخلايا السلفية الليفية الدهنية المنشأ (FAPs) والخلايا الجذعية العضلية (MuSCs) أمرا بالغ الأهمية لدراسة وظيفتها البيولوجية في الحالات الفسيولوجية والمرضية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات لعزل وتنقية وزراعة FAPs و MuSCs من عضلات الفئران البالغة.
Abstract
الخلايا السلفية الليفية الشحمية (FAPs) هي مجموعة من الخلايا اللحمية الوسيطة المقيمة في العضلات الهيكلية (MSCs) القادرة على التمييز على طول السلالة الليفية أو الشحمية أو العظمية أو الغضرونية. جنبا إلى جنب مع الخلايا الجذعية العضلية (MuSCs) ، تلعب FAPs دورا حاسما في توازن العضلات وإصلاحها وتجديدها ، مع الحفاظ بنشاط على المصفوفة خارج الخلية (ECM) وإعادة تشكيلها. في الحالات المرضية ، مثل التلف المزمن والحثل العضلي ، تخضع FAPs لتنشيط شاذ وتتمايز إلى خلايا ليفية منتجة للكولاجين والخلايا الشحمية ، مما يؤدي إلى التليف وتسلل الدهون العضلية. وبالتالي ، تلعب FAPs دورا مزدوجا في تجديد العضلات ، إما عن طريق الحفاظ على دوران MuSC وتعزيز إصلاح الأنسجة أو المساهمة في تكوين ندبة ليفية وتسلل الدهون خارج الرحم ، مما يعرض سلامة ووظيفة الأنسجة العضلية الهيكلية للخطر. يعد التنقية المناسبة ل FAPs و MuSCs شرطا أساسيا لفهم الدور البيولوجي لهذه الخلايا في الظروف الفسيولوجية وكذلك في الحالات المرضية. هنا ، نصف طريقة موحدة للعزل المتزامن ل FAPs و MuSCs من عضلات الأطراف للفئران البالغة باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS). يصف البروتوكول بالتفصيل التفكك الميكانيكي والإنزيمي للخلايا أحادية النواة من عضلات الأطراف بأكملها وعضلات الظنبوب الأمامية (TA) المصابة. يتم عزل FAPs و MuSCs لاحقا باستخدام فارز خلايا شبه آلي للحصول على مجموعات خلايا نقية. بالإضافة إلى ذلك ، نصف طريقة محسنة لزراعة FAPs و MuSCs الهادئة والمنشطة ، إما بمفردها أو في ظروف الزراعة المشتركة.
Introduction
العضلات الهيكلية هي أكبر نسيج في الجسم ، وهو ما يمثل ~ 40 ٪ من وزن الإنسان البالغ ، وهي مسؤولة عن الحفاظ على الموقف ، وتوليد الحركة ، وتنظيم استقلاب الطاقة الأساسية ، ودرجة حرارة الجسم1. العضلات الهيكلية هي نسيج ديناميكي للغاية وتمتلك قدرة ملحوظة على التكيف مع مجموعة متنوعة من المحفزات ، مثل الإجهاد الميكانيكي ، والتغيرات الأيضية ، والعوامل البيئية اليومية. بالإضافة إلى ذلك ، تتجدد العضلات الهيكلية استجابة للإصابة الحادة ، مما يؤدي إلى استعادة كاملة لمورفولوجيتها ووظائفها2. تعتمد لدونة العضلات الهيكلية بشكل أساسي على مجموعة من الخلايا الجذعية العضلية المقيمة (MuSCs) ، والتي تسمى أيضا الخلايا الساتلية ، والتي تقع بين غشاء البلازما من الألياف العضلية والصفيحة القاعدية 2,3. في ظل الظروف العادية ، توجد MuSCs في مكان العضلات في حالة هادئة ، مع عدد قليل من الانقسامات للتعويض عن دوران الخلايا وتجديد مجموعة الخلايا الجذعية4. استجابة للإصابة ، تدخل MuSCs دورة الخلية ، وتتكاثر ، وتساهم إما في تكوين ألياف عضلية جديدة أو تعود إلى مكانتها في عملية تجديد ذاتي 2,3. بالإضافة إلى MuSCs ، تعتمد الصيانة الاستتبابية وتجديد العضلات الهيكلية على دعم مجموعة من الخلايا المقيمة في العضلات تسمى السلف الليفي الشحمي (FAPs) 5،6،7. FAPs هي خلايا لحمية وسيطة مدمجة في النسيج الضام العضلي وقادرة على التمييز على طول السلالة الليفية أو الشحمية أو العظمية أو الغضروفية5،8،9،10. توفر FAPs الدعم الهيكلي ل MuSCs لأنها مصدر لبروتينات المصفوفة خارج الخلية في مجال الخلايا الجذعية العضلية. كما تعزز FAPs الصيانة طويلة الأجل للعضلات الهيكلية عن طريق إفراز السيتوكينات وعوامل النمو التي توفر الدعم الغذائي لتكوين العضلات ونمو العضلات 6,11. عند الإصابة العضلية الحادة ، تتكاثر FAPs بسرعة لإنتاج مكانة عابرة تدعم السلامة الهيكلية للعضلات المجددة وتوفر بيئة مواتية للحفاظ على انتشار MuSCs والتمايز بطريقة باراكرين5. مع استمرار التجديد ، يتم مسح FAPs من العضلات التجديدية عن طريق موت الخلايا المبرمج ، وتعود أعدادها تدريجيا إلى المستوى القاعدي12. ومع ذلك ، في الظروف التي تفضل إصابة العضلات المزمنة ، تتجاوز FAPs الإشارات المؤيدة للاستماتة وتتراكم في مكانة العضلات ، حيث تتمايز إلى الخلايا الليفية المنتجة للكولاجين والخلايا الدهنية ، مما يؤدي إلى تسلل الدهون خارج الرحم وتشكيل ندبة ليفية12,13.
نظرا لتعدد قدراتها وقدراتها التجديدية ، تم تحديد FAPs و MuSCs كأهداف محتملة في الطب التجديدي لعلاج اضطرابات العضلات الهيكلية. لذلك ، للتحقيق في وظيفتها وإمكاناتها العلاجية ، من المهم إنشاء بروتوكولات فعالة وقابلة للتكرار لعزل وثقافة FAPs و MuSCs.
يمكن لفرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) تحديد مجموعات الخلايا المختلفة بناء على الخصائص المورفولوجية مثل الحجم والدقة ، ويسمح بالعزل الخاص بالخلية بناء على استخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات سطح الخلية. في الفئران البالغة ، تعبر MuSCs عن جزيء التصاق الخلايا الوعائية 1 (VCAM-1 ، المعروف أيضا باسم CD106) 14,15 و α7-Integrin15 ، بينما تعبر FAPs عن مستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية α (PDGFRα) ومستضد الخلايا الجذعية 1 (Sca1 أو Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 . في البروتوكول الموصوف هنا ، تم تحديد MuSCs على أنها CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ ، في حين تم تحديد FAPs على أنها CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. بدلا من ذلك ، تم استخدام الفئران PDGFRαEGFP لعزل FAPs مثل CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- الأحداث18,19. علاوة على ذلك ، قارنا التداخل بين إشارة الفلورسنت لخلايا PDGFRα-GFP + بالخلايا التي حددتها علامة السطح Sca1. أظهر تحليلنا أن جميع الخلايا المعبرة عن GFP كانت إيجابية أيضا ل Sca1 ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام أي من النهجين لتحديد وعزل FAPs. وأخيرا ، أكد التلطيخ بأجسام مضادة محددة العلامة نقاء كل مجموعة خلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن إنشاء بروتوكولات فعالة وقابلة للتكرار لتحديد وعزل مجموعات الخلايا الجذعية البالغة النقية هو الخطوة الأولى والأكثر أهمية نحو فهم وظيفتها. يمكن استخدام FAPs المعزولة و MuSCs لإجراء تحليل متعدد الخلايا في تجارب الزرع كعلاج محتمل للأمراض العضلية أو يمكن تعديلها وراثيا لنمذجة المرض في العلاج …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر توم تشيونغ (جامعة هونغ كونغ للعلوم والتكنولوجيا) على المشورة بشأن عزل MuSC. تم تمويل هذا العمل من قبل NIAMS-IRP من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة AR041126 و AR041164.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. 发育生物学. 326 (1), 47-59 (2009).
