Mikrofluidik är ett kraftfullt verktyg för utveckling av diagnostiska tester. Men dyr utrustning och material, liksom mödosamma tillverknings- och hanteringstekniker, krävs ofta. Här beskriver vi tillverkningsprotokollet för en akrylmikrofluidisk enhet för magnetiska mikro- och nanopartikelbaserade immunanalyser i en billig och enkel att använda miljö.
Mikrofluidiska system har kraftigt förbättrade immunanalystekniker. Många mikrofabrikationstekniker kräver dock specialiserad, dyr eller komplicerad utrustning, vilket gör tillverkningen kostsam och oförenlig med massproduktion, vilket är en av de viktigaste förutsättningarna för att patientnära tester (POCT) ska antas i miljöer med låg resurs. Detta arbete beskriver tillverkningsprocessen för en akryl (polymetylmetakrylat, PMMA) -enhet för nanopartikelkonjugerad enzymatisk immunanalystestning med hjälp av datorns numeriska kontroll (CNC) mikrofräsningsteknik. Funktionen hos den mikrofluidiska anordningen visas genom att utföra en immunanalys för att detektera en kommersiell antikropp med användning av lysozym som ett modellantigen konjugerat till 100 nm magnetiska nanopartiklar. Denna enhet integrerar en fysisk förskjuten begränsning på endast 5 μm i höjd, som används för att fånga magnetiska mikropartiklar som utgör en magnetisk fälla genom att placera en extern magnet. På detta sätt är den magnetiska kraften på immunstödet hos konjugerade nanopartiklar tillräcklig för att fånga dem och motstå flödesmotstånd. Denna mikrofluidiska anordning är särskilt lämplig för billig massproduktion utan förlust av precision för immunanalysprestanda.
Under de senaste åren har mikrofluidik spelat en viktig roll i immunanalystekniker1. Miniatyriseringsteknik har många enastående fördelar jämfört med traditionella immunanalyser, såsom minskad prov- och reagensförbrukning, kortare inkubationstider, effektivt lösningsutbyte och högre integration och automatisering2.
Dessutom minskar mikrofluidiska system i immunanalyser, i kombination med magnetiska nanopartiklar som immunstöd, avsevärt inkubationstiderna och uppnår hög detektionskänslighet på grund av det ökade yt-till-volym-förhållandet3. Partiklarnas bruna rörelse förbättrar reaktionskinetiken under bildandet av antigen-antikroppskomplexet 4,5. Dessutom ger nanopartiklarnas magnetiska egenskaper mångsidigheten att integreras i olika mikrofluidiska enhetskonfigurationer, vilket gör dem till en idealisk kandidat för signalering och molekylfångst i miniatyriserade biosensingsystem på chip5. Magnetiska krafter är emellertid betydligt svagare än dragkrafter på nanometerskalan på grund av det höga förhållandet mellan yta och volym6. Därför kan det vara utmanande att fånga nanopartiklar för viktiga immunanalyssteg som tvätt och detektion, och en konventionell magnet är otillräcklig4.
Ett effektivt sätt att manipulera nanopartiklarna är användningen av en mikrofluidisk magnetisk fälla bildad av järnmikropartiklar, som är förpackade i en mikrofluidisk struktur3. Därför, när en extern magnet närmar sig, skapas en komplex interaktion inom det magnetiserade porösa mediet mellan magnet- och flödeskrafterna. Den magnetiska kraften som verkar på nanopartiklarna är tillräckligt stark för att fånga dem och motstå flödesmotstånd 3,4,7. Detta tillvägagångssätt kräver mikrofabrikationstekniker som uppnår upplösningar i storleksordningen några mikrometer för att generera mikrometriska strukturer som behåller mikropartiklarna.
Nuvarande mikrofabrikationstekniker möjliggör högupplöst tillverkning av strukturer från några mikron till hundratals nanometer8. Många av dessa tekniker kräver dock specialiserad, dyr eller komplicerad utrustning. En av de största svårigheterna är kravet på ett renrum för formtillverkning, vilket fortfarande är dyrt och tidskrävande 8,9. Nyligen har mikrofluidiska ingenjörer övervunnit denna nackdel genom att utveckla en mängd alternativa tillverkningsmetoder, med olika fördelar som minskade kostnader, snabbare handläggningstider, billigare material och verktyg och ökad funktionalitet8. På detta sätt medförde utvecklingen av nya mikrofabrikationstekniker billiga, icke-renrumsmetoder som uppnår upplösningar så låga som 10 μm8. Mönstring kan användas direkt på ett substrat utan att generera ett dyrt formmönster, vilket undviker en tidskrävande process. Direkta tillverkningsmetoder inkluderar CNC-fräsning, laserablation och direkt litografi8. Alla dessa metoder är lämpliga för att producera kanaler med hög aspektförhållande i ett brett spektrum av material, oavsett hårdhet9, vilket möjliggör nya och fördelaktiga geometrier, fysiska beteenden och kvaliteter i mikrofluidiska enheter8.
CNC-mikrofräsning skapar strukturer i mikroskala med hjälp av skärverktyg som tar bort bulkmaterial från ett substrat och är en effektiv tillverkningsmetod för mikrofluidiska enheter10,11. Mikrofräsningstekniken kan vara användbar i mikrofluidiska applikationer för att skapa mikrokanaler och funktioner direkt på arbetsytan, vilket ger en viktig fördel: ett arbetsstycke kan tillverkas på kort tid (mindre än 30 minuter), vilket avsevärt minskar handläggningstiden från design till prototyp12. Dessutom gör den stora tillgången på skärtillbehör av olika material, storlekar och former CNC-fräsmaskiner till ett lämpligt verktyg som har möjliggjort tillverkning av olika funktioner i många typer av billiga engångsmaterial13.
Bland alla material som vanligtvis används vid mikrofräsning är termoplaster fortfarande ett ledande val på grund av deras många gynnsamma egenskaper och kompatibilitet med biologiska tillämpningar10,14. Termoplaster är ett attraktivt substrat för mikrofluidiska system på grund av deras betydande fördelar för att utveckla billiga engångsanalyssystem9. Dessutom är dessa material mycket mottagliga för tillverkningsprocesser med hög volym, vilket gör dem lämpliga för kommersialisering och massproduktion. Av dessa skäl har termoplaster som PMMA ansetts vara pålitliga och robusta material sedan de första åren av mikrofluidik10. Olika protokoll har beskrivits för att tillverka slutna kanaler i termoplaster, såsom lösningsmedelsbindning15, värmebindning 16 och ultraviolett (UV) / ozonytbehandlingsbindning17.
I många fall är positioneringsupplösningen som uppnås med konventionella mikrofräsmaskiner inte tillräcklig för vissa mikrofluidiska applikationer som kräver strukturer mindre än 10 μm. High-end micromilling har tillräckligt med upplösning. Tyvärr, på grund av höga priser, är dess användning begränsad till en handfull användare12. Tidigare rapporterade vår forskargrupp tillverkning och manipulation av ett billigt verktyg som möjliggör bearbetning av strukturer på mindre än 10 μm, vilket övervinner upplösningen hos konventionella fräsmaskiner12. Fixturen är en plattform tillverkad av 3D-utskrift med enkel elektronik, innehållande tre piezoelektriska ställdon. Ytan innehåller gångjärnsformade fogar som gör att den kan lyftas när de piezoelektriska elementen verkar samtidigt. Z-axelförskjutning kan styras med en upplösning på 500 nm och en noggrannhet på ±1,5 μm12.
Detta dokument presenterar stegen i tillverkningsprocessen för en akrylanordning (PMMA) genom en mikromillingteknik. Spåndesignen består av en huvudkanal 200 μm bred och 200 μm hög och en sidokanal med samma dimensioner för att rensa flödet av reagenserna. I den centrala regionen avbryts kanalen av en fysisk begränsning på endast 5 μm i höjd, tillverkad med den 3D-tryckta piezoelektriska plattformen tillverkad av denna grupp12, för att fånga magnetiska mikropartiklar som utgör en magnetisk fälla för nanopartiklar genom att placera en extern magnet. Vi visar hur den mikrofluidiska anordningen fungerar genom att utföra en immunanalys för att detektera en kommersiell antikropp med hjälp av lysozym som ett modellantigen konjugerat till 100 nm magnetiska nanopartiklar. Denna enhet kombinerar olika funktioner som gör den unik4: användningen av magnetiska nanopartiklar som immunstöd minskar den totala testtiden från timmar till minuter; Användning av ett fluorogent enzym för detektion möjliggör detektionsgränser som är jämförbara med dem för standardenzymbundna immunosorbentanalyser (ELISA). och användningen av en termoplast som tillverkningsmaterial gör den kompatibel med massproduktion, vilket inte var fallet för tidigare mikrofluidiska nanopartiklars magnetiska fällor3, och gör det till en utmärkt kandidat att utveckla POCT.
En akrylmikrofluidisk anordning för immunanalyser med nanopartiklar som immunstöd tillverkades med hjälp av en mikromillingteknik. Metoden för direkt tillverkning på substratet har fördelen att man undviker användning av en huvudform och den tid och de kostnader som detta innebär. Det är dock begränsat till snabb prototypframställning och tillverkning av enheter med hög volym.
Här använde vi en tidigare rapporterad tillbehörspiezoelektrisk plattform för fräsmaskinen<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Conacyt, Mexiko under bidrag 312231 av “Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación”, och av AMEXCID och Mexikos utrikesministerium (SRE) under bidrag “Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2”. JAHO tackar Conacyt Mexico för deras doktorandstipendium.
0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12 |
0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12 |
Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
Extraction hood | Unknown | Unknown | |
Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
Mechanic press | Home-made | ||
Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |