الطحن الدقيق للتحكم العددي بالكمبيوتر لجهاز أكريليك الموائع الدقيقة مع تقييد متداخل للمقايسات المناعية المغناطيسية القائمة على الجسيمات النانوية
Summary
الموائع الدقيقة هي أداة قوية لتطوير الاختبارات التشخيصية. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى معدات ومواد باهظة الثمن ، بالإضافة إلى تقنيات التصنيع والمناولة الشاقة. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول تصنيع جهاز الموائع الدقيقة الأكريليك للمقايسات المناعية المغناطيسية الدقيقة والجسيمات النانوية في بيئة منخفضة التكلفة وسهلة الاستخدام.
Abstract
حسنت أنظمة الموائع الدقيقة تقنيات المقايسة المناعية بشكل كبير. ومع ذلك ، تتطلب العديد من تقنيات التصنيع الدقيق معدات متخصصة أو باهظة الثمن أو معقدة ، مما يجعل التصنيع مكلفا وغير متوافق مع الإنتاج الضخم ، وهو أحد أهم الشروط المسبقة لاختبارات نقطة الرعاية (POCT) التي يجب اعتمادها في البيئات منخفضة الموارد. يصف هذا العمل عملية تصنيع جهاز أكريليك (بولي ميثيل ميثاكريلات، PMMA) لاختبار المقايسة المناعية الأنزيمية المترافقة بالجسيمات النانوية باستخدام تقنية الطحن الدقيق للتحكم العددي بالحاسوب (CNC). يظهر عمل جهاز الموائع الدقيقة من خلال إجراء اختبار مناعي للكشف عن جسم مضاد تجاري باستخدام الليزوزيم كمستضد نموذجي مترافق مع جسيمات نانوية مغناطيسية 100 نانومتر. يدمج هذا الجهاز قيدا ماديا متداخلا يبلغ ارتفاعه 5 ميكرومتر فقط ، ويستخدم لالتقاط الجسيمات الدقيقة المغناطيسية التي تشكل مصيدة مغناطيسية عن طريق وضع مغناطيس خارجي. وبهذه الطريقة ، تكون القوة المغناطيسية على الدعم المناعي للجسيمات النانوية المترافقة كافية لالتقاطها ومقاومة سحب التدفق. جهاز الموائع الدقيقة هذا مناسب بشكل خاص للإنتاج الضخم منخفض التكلفة دون فقدان الدقة لأداء المقايسة المناعية.
Introduction
في السنوات الأخيرة ، لعبت الموائع الدقيقة دورا مهما في تقنيات المقايسة المناعية1. تتميز تقنية التصغير بالعديد من المزايا البارزة مقارنة بالمقايسات المناعية التقليدية ، مثل تقليل استهلاك العينات والكواشف ، وأوقات الحضانة الأقصر ، وتبادل الحلول بكفاءة ، والتكامل العالي والأتمتة2.
علاوة على ذلك ، فإن أنظمة الموائع الدقيقة في المقايسات المناعية ، بالاشتراك مع الجسيمات النانوية المغناطيسية كدعم مناعي ، تقلل بشكل كبير من أوقات الحضانة ، مما يحقق حساسية عالية للكشف بسبب زيادة نسبة السطح إلى الحجم3. تعمل الحركة البراونية للجزيئات على تحسين حركية التفاعل أثناء تكوين مجمع الأجسام المضادةللمستضد 4,5. علاوة على ذلك ، توفر الخصائص المغناطيسية للجسيمات النانوية تنوعا ليتم دمجها في تكوينات مختلفة لأجهزة الموائع الدقيقة ، مما يجعلها مرشحا مثاليا للإشارة والتقاط الجزيئات في أنظمة الاستشعار الحيوي المصغرة على الرقاقة5. ومع ذلك ، فإن القوى المغناطيسية أضعف بكثير من قوى السحب على مقياس النانومتر بسبب ارتفاع نسبة السطح إلى الحجم6. لذلك ، قد يكون التقاط الجسيمات النانوية لخطوات المقايسة المناعية الحاسمة مثل الغسيل والكشف أمرا صعبا ، والمغناطيس التقليدي غير كاف4.
طريقة فعالة لمعالجة الجسيمات النانوية هي استخدام مصيدة مغناطيسية موائع دقيقة تتكون من جزيئات الحديد الدقيقة ، والتي يتم تعبئتها في بنية الموائع الدقيقة3. لذلك ، عندما يقترب مغناطيس خارجي ، يتم إنشاء تفاعل معقد داخل الوسط المسامي الممغنط بين القوى المغناطيسية وقوى التدفق. القوة المغناطيسية المؤثرة على الجسيمات النانوية قوية بما يكفي لالتقاطها ومقاومة سحب التدفق3،4،7. يتطلب هذا النهج تقنيات التصنيع الدقيق التي تحقق قرارات في حدود بضعة ميكرومترات لتوليد هياكل ميكرومترية تحتفظ بالجسيمات الدقيقة.
تسمح تقنيات التصنيع الدقيق الحالية بتصنيع الهياكل عالية الدقة من بضعة ميكرونات إلى مئات النانومتر8. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه التقنيات تتطلب معدات متخصصة أو باهظة الثمن أو معقدة. تتمثل إحدى الصعوبات الرئيسية في الحاجة إلى غرفة أبحاث لتصنيع القوالب ، والتي لا تزال مكلفة وتستغرق وقتا طويلا 8,9. في الآونة الأخيرة ، تغلب مهندسو الموائع الدقيقة على هذا العيب من خلال تطوير مجموعة متنوعة من طرق التصنيع البديلة ، مع مزايا مختلفة مثل انخفاض التكاليف ، وأوقات التسليم الأسرع ، والمواد والأدوات الأرخص ، وزيادة الوظائف8. وبهذه الطريقة ، أدى تطوير تقنيات التصنيع الدقيق الجديدة إلى جلب طرق منخفضة التكلفة وغير غرف الأبحاث تحقق دقة منخفضة تصل إلى 10 ميكرومتر8. يمكن استخدام الزخرفة مباشرة على الركيزة دون إنشاء نمط صب باهظ الثمن ، وبالتالي تجنب عملية تستغرق وقتا طويلا. تشمل طرق التصنيع المباشر الطحن باستخدام الحاسب الآلي والاجتثاث بالليزر والطباعة الحجرية المباشرة8. كل هذه الطرق مناسبة لإنتاج قنوات ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية في مجموعة واسعة من المواد ، بغض النظر عن صلابتها9 ، مما يتيح هندسة وسلوكيات فيزيائية وصفات جديدة ومفيدة في أجهزة الموائع الدقيقة8.
يقوم الطحن الدقيق CNC بإنشاء هياكل مجهرية باستخدام أدوات القطع التي تزيل المواد السائبة من الركيزة وهي طريقة تصنيع فعالة لأجهزة الموائع الدقيقة10,11. يمكن أن تكون تقنية micromilling مفيدة في تطبيقات الموائع الدقيقة لإنشاء قنوات وميزات دقيقة مباشرة على سطح العمل ، مما يوفر ميزة رئيسية: يمكن تصنيع قطعة العمل في وقت قصير (أقل من 30 دقيقة) ، مما يقلل بشكل كبير من وقت الاستجابة من التصميم إلى النموذج الأولي12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التوافر الواسع لملحقات القطع من مختلف المواد والأحجام والأشكال يجعل آلات الطحن CNC أداة مناسبة سمحت بتصنيع ميزات مختلفة في العديد من أنواع المواد منخفضة التكلفة التي تستخدم لمرة واحدة13.
من بين جميع المواد المستخدمة بشكل شائع في الطحن الدقيق ، تظل اللدائن الحرارية خيارا رائدا نظرا لخصائصها المواتية العديدة وتوافقها مع التطبيقات البيولوجية10,14. تعتبر اللدائن الحرارية ركيزة جذابة لأنظمة الموائع الدقيقة نظرا لمزاياها الكبيرة لتطوير أنظمة تحليلية منخفضة التكلفة يمكن التخلص منها9. بالإضافة إلى ذلك ، هذه المواد قابلة للغاية لعمليات التصنيع ذات الحجم الكبير ، مما يجعلها مناسبة للتسويق والإنتاج الضخم. لهذه الأسباب ، تم اعتبار اللدائن الحرارية مثل PMMA مواد موثوقة وقوية منذ السنوات الأولى من الموائع الدقيقة10. تم وصف بروتوكولات مختلفة لتصنيع القنوات المغلقة في اللدائن الحرارية ، مثل الترابط بالمذيبات15 ، والترابط الحراري 16 ، والأشعة فوق البنفسجية (UV) / رابطة المعالجة السطحية للأوزون17.
في كثير من الحالات ، لا تكون دقة تحديد المواقع التي تم تحقيقها باستخدام آلات الطحن الدقيقة التقليدية كافية لبعض تطبيقات الموائع الدقيقة التي تتطلب هياكل أصغر من 10 ميكرومتر. الطحن الدقيق المتطور لديه دقة كافية. لسوء الحظ ، نظرا لارتفاع الأسعار ، يقتصر استخدامه على حفنة من المستخدمين12. في السابق ، أبلغت مجموعتنا البحثية عن تصنيع ومعالجة أداة منخفضة التكلفة تسمح بهياكل تصنيع أقل من 10 ميكرومتر ، والتغلب على دقة آلات الطحن التقليدية12. لاعبا اساسيا عبارة عن منصة تم تصنيعها بواسطة طباعة 3D مع إلكترونيات بسيطة ، تحتوي على ثلاثة مشغلات كهرضغطية. يحتوي السطح على مفاصل على شكل مفصلي تسمح برفعه عندما تعمل العناصر الكهرضغطية في وقت واحد. يمكن التحكم في إزاحة المحور Z بدقة 500 نانومتر ودقة ±1.5 ميكرومتر12.
يعرض هذا البحث خطوات عملية تصنيع جهاز الأكريليك (PMMA) من خلال تقنية الطحن الدقيق. يتكون تصميم الرقاقة من قناة رئيسية بعرض 200 ميكرومتر وارتفاع 200 ميكرومتر وقناة جانبية بنفس الأبعاد لتطهير تدفق الكواشف. في المنطقة الوسطى ، تتم مقاطعة القناة من خلال تقييد مادي يبلغ ارتفاعه 5 ميكرومتر فقط ، ملفقة بمنصة كهرضغطية مطبوعة ثلاثية الأبعاد صنعتها هذه المجموعة12 ، لالتقاط الجسيمات الدقيقة المغناطيسية التي تشكل مصيدة مغناطيسية للجسيمات النانوية عن طريق وضع مغناطيس خارجي. نعرض تشغيل جهاز الموائع الدقيقة عن طريق إجراء اختبار مناعي للكشف عن جسم مضاد تجاري باستخدام الليزوزيم كمستضد نموذجي مترافق مع جسيمات نانوية مغناطيسية 100 نانومتر. يجمع هذا الجهاز بين ميزات مختلفة تجعله فريدا4: استخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية كدعم مناعي يقلل من إجمالي وقت الاختبار من ساعات إلى دقائق. يسمح استخدام إنزيم فلوري للكشف بحدود للكشف يمكن مقارنتها بحدود مقايسات الممتز المناعي القياسية المرتبطة بالإنزيم (ELISAs) ؛ واستخدام اللدائن الحرارية كمواد تصنيع يجعلها متوافقة مع الإنتاج الضخم ، وهو ما لم يكن عليه الحال بالنسبة للمصائد المغناطيسيةالسابقة لجسيمات الموائع الدقيقة النانوية 3 ، ويجعلها مرشحا ممتازا لتطوير POCT.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصنيع جهاز الموائع الدقيقة الأكريليك للمقايسات المناعية باستخدام الجسيمات النانوية كدعم مناعي باستخدام تقنية الطحن الدقيق. تتميز طريقة التصنيع المباشر على الركيزة بميزة تجنب استخدام القالب الرئيسي والوقت والتكاليف التي ينطوي عليها ذلك. ومع ذلك ، فإنه يقتصر على النماذج الأولية السري…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل Conacyt، المكسيك بموجب منحة 312231 من “برنامج Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación”، ومن AMEXCID ووزارة العلاقات الخارجية المكسيكية (SRE) بموجب منحة “Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2”. JAHO تشكر Conacyt Mexico على منحة الدكتوراه.
Materials
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
- Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R. Immunoassays in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 991-1007 (2010).
- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
- Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
- Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).
- Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
- Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , 1-24 (2017).
- Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).
- Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60 (2018).
- Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
- Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
- Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
- Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
- Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
- Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
- Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
- Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
- Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
- Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).
- Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).
