Summary

Microfresagem de Controle Numérico Computacional de um Dispositivo Acrílico Microfluídico com uma Restrição Escalonada para Imunoensaios Magnéticos Baseados em Nanoppartículas

Published: June 23, 2022
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Summary

A microfluídica é uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento de testes de diagnóstico. No entanto, equipamentos e materiais caros, bem como técnicas de fabricação e manuseio trabalhosas, são frequentemente necessários. Aqui, detalhamos o protocolo de fabricação de um dispositivo microfluídico acrílico para imunoensaios magnéticos baseados em micro e nanopartículas em um ambiente de baixo custo e simples de usar.

Abstract

Os sistemas microfluídicos melhoraram muito as técnicas de imunoensaio. No entanto, muitas técnicas de microfabricação exigem equipamentos especializados, caros ou complicados, tornando a fabricação cara e incompatível com a produção em massa, que é uma das pré-condições mais importantes para que os testes no local de atendimento (POCT) sejam adotados em ambientes com poucos recursos. Este trabalho descreve o processo de fabricação de um dispositivo acrílico (polimetilmetacrilato, PMMA) para teste de imunoensaio enzimático conjugado com nanopartículas utilizando a técnica de microfresagem de controle numérico computadorizado (CNC). O funcionamento do dispositivo microfluídico é demonstrado pela realização de um imunoensaio para detectar um anticorpo comercial usando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo integra uma restrição física escalonada de apenas 5 μm de altura, usada para capturar micropartículas magnéticas que compõem uma armadilha magnética colocando um ímã externo. Desta forma, a força magnética sobre o imunosuporte de nanopartículas conjugadas é suficiente para capturá-las e resistir ao arrasto de fluxo. Este dispositivo microfluídico é particularmente adequado para produção em massa de baixo custo sem a perda de precisão para o desempenho do imunoensaio.

Introduction

Nos últimos anos, a microfluídica tem desempenhado um papel importante nas técnicas de imunoensaio1. A tecnologia de miniaturização tem muitas vantagens notáveis em comparação com os imunoensaios tradicionais, como consumo reduzido de amostras e reagentes, tempos de incubação mais curtos, troca eficiente de soluções e maior integração e automação2.

Além disso, sistemas microfluídicos em imunoensaios, em associação com nanopartículas magnéticas como imunosuporte, reduzem consideravelmente os tempos de incubação, alcançando alta sensibilidade de detecção devido ao aumento da relação superfície-volume3. O movimento browniano das partículas melhora a cinética de reação durante a formação do complexo antígeno-anticorpo 4,5. Além disso, as propriedades magnéticas das nanopartículas proporcionam a versatilidade para serem integradas em diferentes configurações de dispositivos microfluídicos, tornando-as um candidato ideal para sinalização e captura de moléculas em sistemas de biossensoriamento miniaturizados on-chip5. No entanto, as forças magnéticas são significativamente mais fracas do que as forças de arrasto na escala nanométrica devido à alta relação superfície-volume6. Portanto, a captura de nanopartículas para etapas cruciais de imunoensaio, como lavagem e detecção, pode ser um desafio, e um ímã convencional é insuficiente4.

Uma maneira eficiente de manipular as nanopartículas é o uso de uma armadilha magnética microfluídica formada por micropartículas de ferro, que são embaladas em uma estrutura microfluídica3. Portanto, quando um ímã externo se aproxima, uma interação complexa é criada dentro do meio poroso magnetizado entre as forças magnéticas e de fluxo. A força magnética que atua sobre as nanopartículas é forte o suficiente para capturá-las e resistir ao arrasto do fluxo 3,4,7. Essa abordagem requer técnicas de microfabricação que atinjam resoluções da ordem de alguns micrômetros para gerar estruturas micrométricas que retenham as micropartículas.

As técnicas atuais de microfabricação permitem a fabricação de estruturas de alta resolução de alguns mícrons a centenas de nanômetros8. No entanto, muitas dessas técnicas exigem equipamentos especializados, caros ou complicados. Uma das principais dificuldades é a exigência de uma sala limpa para fabricação de moldes, que continua dispendiosa e demorada 8,9. Recentemente, os engenheiros microfluídicos superaram essa desvantagem desenvolvendo uma variedade de métodos alternativos de fabricação, com várias vantagens, como custos reduzidos, tempos de resposta mais rápidos, materiais e ferramentas mais baratos e maior funcionalidade8. Desta forma, o desenvolvimento de novas técnicas de microfabricação trouxe métodos de baixo custo, não limpos, que alcançam resoluções tão baixas quanto 10 μm8. A padronização pode ser usada diretamente em um substrato sem gerar um padrão de moldagem caro, evitando assim um processo demorado. Os métodos de fabricação direta incluem fresamento CNC, ablação a laser e litografia direta8. Todos esses métodos são adequados para a produção de canais de alta relação de aspecto em uma ampla gama de materiais, independentemente de sua dureza9, possibilitando novas e vantajosas geometrias, comportamentos físicos e qualidades em dispositivos microfluídicos8.

A microfresagem CNC cria estruturas em microescala utilizando ferramentas de corte que removem material a granel de um substrato e é um método de fabricação eficaz para dispositivos microfluídicos10,11. A técnica de microfresagem pode ser útil em aplicações microfluídicas para criar microcanais e recursos diretamente na superfície de trabalho, oferecendo uma vantagem fundamental: uma peça de trabalho pode ser fabricada em um curto espaço de tempo (menos de 30 min), reduzindo significativamente o tempo de resposta desde o projeto até o protótipo12. Além disso, a ampla disponibilidade de acessórios de corte de diferentes materiais, tamanhos e formas torna as fresadoras CNC uma ferramenta adequada que permitiu a fabricação de diferentes características em muitos tipos de materiais descartáveis de baixo custo13.

Dentre todos os materiais comumente utilizados na micromoagem, os termoplásticos continuam sendo uma escolha líder devido às suas muitas propriedades favoráveis e compatibilidade com aplicações biológicas10,14. Os termoplásticos são um substrato atraente para sistemas microfluídicos devido às suas vantagens significativas para o desenvolvimento de sistemas analíticos descartáveis de baixo custo9. Além disso, esses materiais são altamente passíveis de processos de fabricação de alto volume, tornando-os adequados para comercialização e produção em massa. Por essas razões, termoplásticos como o PMMA têm sido considerados materiais confiáveis e robustos desde os primórdios da microfluídica10. Diferentes protocolos têm sido descritos para fabricar canais fechados em termoplásticos, como a ligação por solvente15, a ligação por calor16 e a ligação ultravioleta (UV)/ozônio para tratamento superficial17.

Em muitos casos, a resolução de posicionamento alcançada com microfresadoras convencionais não é suficiente para algumas aplicações microfluídicas que exigem estruturas menores que 10 μm. A microfresagem de alta qualidade tem resolução suficiente. Infelizmente, devido aos altos preços, seu uso é limitado a um punhado de usuários12. Anteriormente, nosso grupo de pesquisa relatou a fabricação e manipulação de uma ferramenta de baixo custo que permite usinagem de estruturas inferiores a 10 μm, superando a resolução de fresadoras convencionais12. O acessório é uma plataforma fabricada por impressão 3D com eletrônica simples, contendo três atuadores piezoelétricos. A superfície contém juntas em forma de dobradiça que permitem que ela seja levantada quando os elementos piezoelétricos agem simultaneamente. O deslocamento do eixo Z pode ser controlado com uma resolução de 500 nm e uma precisão de ±1,5 μm12.

Este trabalho apresenta as etapas do processo de fabricação de um dispositivo acrílico (PMMA) através de uma técnica de microfresagem. O projeto do chip consiste em um canal principal de 200 μm de largura e 200 μm de altura e um canal lateral com as mesmas dimensões para purgar o fluxo dos reagentes. Na região central, o canal é interrompido por uma restrição física de apenas 5 μm de altura, fabricada com a plataforma piezoelétrica impressa em 3D feita por esse grupo12, para capturar micropartículas magnéticas que compõem uma armadilha magnética para nanopartículas através da colocação de um ímã externo. Mostramos o funcionamento do dispositivo microfluídico através da realização de um imunoensaio para detectar um anticorpo comercial usando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo combina diferentes características que o tornam único4: o uso de nanopartículas magnéticas como suporte imunológico reduz o tempo total de teste de horas para minutos; a utilização de uma enzima fluorogénica para detecção permite limites de detecção comparáveis aos dos ensaios imunoenzimáticos padrão (ELISAs); e o uso de um termoplástico como material de fabricação o torna compatível com a produção em massa, o que não foi o caso das armadilhas magnéticas3 das nanopartículas microfluídicas anteriores, e o torna um excelente candidato para o desenvolvimento do POCT.

Protocol

1. Micromoagem Moagem de superfícieLigue a microfresadora e o controlador piezoelétrico. Inicie seu respectivo software de controle12. Selecione os bits finais do moinho necessários (diâmetros de 200 μm e 800 μm). Colocá-los no compartimento apropriado da fresadora (Figura 1). Corte retângulos de 9 mm x 25 mm de PMMA de 1,3 mm de espessura com o bit final do moinho de 800 μm. Anexe cuidadosamente um des…

Representative Results

Foi possível estabelecer um protocolo de fabricação altamente reprodutível que melhora a resolução da técnica de micromoagem convencional. Usando este protocolo, a fabricação de um canal tão pequeno quanto 5 μm de altura que opera como uma restrição escalonada em um canal de 200 μm de altura é alcançada. O design simples da restrição escalonada captura micropartículas de ferro de 7,5 μm de diâmetro que, quando compactadas no microcanal, permitem a criação de uma armadilha magnética quando um ímã…

Discussion

Um dispositivo microfluídico acrílico para imunoensaios utilizando nanopartículas como imunosuporte foi fabricado utilizando uma técnica de microfresamento. O método de fabricação direta no substrato tem a vantagem de evitar o uso de um molde mestre e o tempo e os custos que isso implica. No entanto, é limitado à prototipagem rápida e fabricação de dispositivos de alto volume.

Aqui, utilizou-se uma plataforma piezoelétrica acessória previamente relatada para a fresadora<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por Conacyt, México, sob subvenção 312231 do “Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación”, e pela AMEXCID e Ministério das Relações Exteriores do México (SRE) sob a subvenção “Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2”. JAHO agradece a Conacyt México por sua bolsa de doutorado.

Materials

0.008 Endmill KYOCERA SGS  2204 2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12
0.032 Endmill KYOCERA SGS  2228 2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12
Carbonyl-iron microparticles  Sigma-Aldrich 44890 7 μm 
Chloroform Fermont 6201 Health Hazard: Moderate
Flammability: None
Reactivity: None
Contact Hazard: Moderate 
CMOS camera Moment Teledyne Photometrics Sensor Technology: CMOS
Quantum Efficiency: 73%
Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm
Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software Roland DGA Corporation Engraving software to design and create the engraving path on the surface
Extraction hood Unknown Unknown
Flexible Plastic Tubing Tygon AAD04103 ID = 0.020, OD = 0.060
Fluorescence microsope  ZEISS Axio Vert.A1
High Precision Dispense Needle Loctite 98612
Homemade piezoelectric controller application LabView  See reference 12 for more details.
Loctite 495 instant adhesive Henkel 49503 Apply with micropipette tip or dispensing needle 
MagJET Separation Rack thermoscientific 12 x 1.5 mL
Mechanic press Home-made
Milling Machine Roland MDX-50
Piezoelectric platform  Home-made See reference 12
Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic Goodfellow ME303018/1 Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent
PVCamTest software Teledyne Photometrics Version 3.10.107  Image acquisition software
Stereo microscope Nikon SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads Ocean NanoTech KSC0100 100 nm
Syringe pump kd Scientific  KDS200 Can hold up to two syringes
Utrasonic bath Branson 2800
VPanel software  Windows OS Version 1.0.3.0 Software for controlling the micromilling machine

References

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Hernández-Ortiz, J. A., Guevara-Pantoja, P. E., Andrade-Medina, M., Carrillo-Tripp, M., Caballero-Robledo, G. A. Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays. J. Vis. Exp. (184), e63899, doi:10.3791/63899 (2022).

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