चुंबकीय नैनोपार्टिकल-आधारित इम्यूनोएसे के लिए एक क्रमबद्ध प्रतिबंध के साथ माइक्रोफ्लुइडिक ऐक्रेलिक डिवाइस का कंप्यूटर न्यूमेरिकल कंट्रोल माइक्रोमिलिंग
Summary
माइक्रोफ्लुइडिक्स नैदानिक परीक्षणों के विकास के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, महंगे उपकरण और सामग्री, साथ ही श्रमसाध्य निर्माण और हैंडलिंग तकनीकों की अक्सर आवश्यकता होती है। यहां, हम कम लागत और सरल-से-उपयोग सेटिंग में चुंबकीय माइक्रो- और नैनोपार्टिकल-आधारित इम्यूनोएसे के लिए एक ऐक्रेलिक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के निर्माण प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं।
Abstract
माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम ने इम्यूनोएसे तकनीकों में काफी सुधार किया है। हालांकि, कई माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों को विशेष, महंगे या जटिल उपकरणों की आवश्यकता होती है, जिससे निर्माण महंगा हो जाता है और बड़े पैमाने पर उत्पादन के साथ असंगत हो जाता है, जो कम संसाधन सेटिंग्स में अपनाए जाने वाले पॉइंट-ऑफ-केयर टेस्ट (पीओसीटी) के लिए सबसे महत्वपूर्ण पूर्व शर्तों में से एक है। यह काम कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण (सीएनसी) माइक्रोमिलिंग तकनीक का उपयोग करके नैनोपार्टिकल-संयुग्मित एंजाइमेटिक इम्यूनोसे परीक्षण के लिए एक ऐक्रेलिक (पॉलीमेथिलमेथैक्रिलेट, पीएमएमए) डिवाइस की निर्माण प्रक्रिया का वर्णन करता है। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के कामकाज को 100 एनएम चुंबकीय नैनोकणों के लिए संयुग्मित मॉडल एंटीजन के रूप में लाइसोजाइम का उपयोग करके एक वाणिज्यिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोसे का प्रदर्शन करके दिखाया गया है। यह उपकरण ऊंचाई में केवल 5 μm के भौतिक क्रमबद्ध प्रतिबंध को एकीकृत करता है, जिसका उपयोग चुंबकीय माइक्रोपार्टिकल्स को पकड़ने के लिए किया जाता है जो बाहरी चुंबक रखकर चुंबकीय जाल बनाते हैं। इस तरह, संयुग्मित नैनोकणों के इम्यूनोसपोर्ट पर चुंबकीय बल उन्हें पकड़ने और प्रवाह खींचने का विरोध करने के लिए पर्याप्त है। यह माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस विशेष रूप से इम्यूनोएसे प्रदर्शन के लिए परिशुद्धता के नुकसान के बिना कम लागत वाले बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए उपयुक्त है।
Introduction
हाल के वर्षों में, माइक्रोफ्लुइडिक्स ने इम्यूनोसे तकनीक1 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। लघुकरण प्रौद्योगिकी में पारंपरिक इम्यूनोएसे की तुलना में कई उत्कृष्ट फायदे हैं, जैसे कि कम नमूना और अभिकर्मक खपत, कम इनक्यूबेशन समय, कुशल समाधान विनिमय, और उच्च एकीकरण और स्वचालन2।
इसके अलावा, इम्यूनोएसे में माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम, इम्यूनोसपोर्ट के रूप में चुंबकीय नैनोकणों के साथ मिलकर, इनक्यूबेशन गुना को काफी कम करते हैं, सतह-से-मात्रा अनुपात में वृद्धि के कारण उच्च पहचान संवेदनशीलता प्राप्त करतेहैं। कणों का ब्राउनियन आंदोलन एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स 4,5 के गठन के दौरान प्रतिक्रिया कैनेटीक्स में सुधार करता है। इसके अलावा, नैनोकणों के चुंबकीय गुण विभिन्न माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस कॉन्फ़िगरेशन में एकीकृत होने के लिए बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करते हैं, जिससे उन्हें लघु ऑन-चिप बायोसेंसिंग सिस्टम5 में सिग्नलिंग और अणु कैप्चर के लिए एक आदर्श उम्मीदवार बना दिया जाता है। हालांकि, उच्च सतह-से-आयतन अनुपात 6 के कारण नैनोमीटर पैमाने पर चुंबकीय बल ड्रैग बलों की तुलना में काफी कमजोरहोते हैं। इसलिए, धोने और पहचान जैसे महत्वपूर्ण इम्यूनोएसे चरणों के लिए नैनोकणों को कैप्चर करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और एक पारंपरिकचुंबक अपर्याप्त है।
नैनोकणों में हेरफेर करने का एक कुशल तरीका लोहे के माइक्रोपार्टिकल्स द्वारा गठित माइक्रोफ्लुइडिक चुंबकीय जाल का उपयोग है, जो एक माइक्रोफ्लुइडिक संरचना3 में पैक किए जाते हैं। इसलिए, जब एक बाहरी चुंबक आता है, तो चुंबकीय और प्रवाह बलों के बीच चुंबकित छिद्रपूर्ण माध्यम के भीतर एक जटिल बातचीत बनाई जाती है। नैनोकणों पर कार्य करने वाला चुंबकीय बल उन्हें पकड़ने और प्रवाह ड्रैग 3,4,7 का विरोध करने के लिए पर्याप्त मजबूत है। इस दृष्टिकोण के लिए माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों की आवश्यकता होती है जो माइक्रोपार्टिकल्स को बनाए रखने वाले माइक्रोमेट्रिक संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए कुछ माइक्रोमीटर के क्रम में संकल्प प्राप्त करते हैं।
वर्तमान माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीक कुछ माइक्रोन से सैकड़ों नैनोमीटर 8 तक संरचनाओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन निर्माण की अनुमति देतीहै। हालांकि, इनमें से कई तकनीकों को विशेष, महंगे या जटिल उपकरणों की आवश्यकता होती है। मुख्य कठिनाइयों में से एक मोल्ड निर्माण के लिए एक क्लीनरूम की आवश्यकता है, जो महंगा और समय लेने वाला 8,9 है। हाल ही में, माइक्रोफ्लुइडिक इंजीनियरों ने विभिन्न प्रकार के वैकल्पिक निर्माण विधियों को विकसित करके इस कमी को दूर किया है, जैसे कि कम लागत, तेजी से टर्नअराउंड समय, सस्ती सामग्री और उपकरण, और बढ़ी हुई कार्यक्षमता8। इस तरह, नई माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों के विकास ने कम लागत वाले, गैर-क्लीनरूम विधियों को लाया जो 10 μm8 जितना कम संकल्प प्राप्त करते हैं। पैटर्निंग का उपयोग एक महंगे मोल्डिंग पैटर्न उत्पन्न किए बिना सीधे सब्सट्रेट पर किया जा सकता है, इस प्रकार समय लेने वाली प्रक्रिया से बचा जा सकता है। प्रत्यक्ष निर्माण विधियों में सीएनसी मिलिंग, लेजर एब्लेशन और डायरेक्ट लिथोग्राफी 8 शामिलहैं। ये सभी विधियां सामग्रियों की एक विस्तृत श्रृंखला में उच्च-पहलू-अनुपात चैनलों का उत्पादन करने के लिए उपयुक्त हैं, उनकी कठोरता9 की परवाह किए बिना, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में नए और लाभप्रद ज्यामिति, भौतिक व्यवहार औरगुणों को सक्षम करते हैं।
सीएनसी माइक्रोमिलिंग काटने वाले उपकरणों का उपयोग करके माइक्रोस्केल संरचनाएं बनाता है जो एक सब्सट्रेट से थोक सामग्री को हटाते हैं और माइक्रोफ्लुइडिकउपकरणों 10,11 के लिए एक प्रभावी निर्माण विधि है। माइक्रोमिलिंग तकनीक माइक्रोचैनलों और सुविधाओं को सीधे काम की सतह पर बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक अनुप्रयोगों में उपयोगी हो सकती है, जो एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करती है: एक वर्कपीस को थोड़े समय (30 मिनट से कम) में बनाया जा सकता है, जिससे डिजाइन से प्रोटोटाइप12 तक टर्नअराउंड समय काफी कम हो जाता है। इसके अलावा, विभिन्न सामग्रियों, आकारों और आकृतियों के काटने के सामान की व्यापक उपलब्धता सीएनसी मिलिंग मशीनों को एक उपयुक्त उपकरण बनाती है जिसने कई प्रकार की कम लागत वाली डिस्पोजेबलसामग्री में विभिन्न विशेषताओं के निर्माण की अनुमति दी है।
माइक्रोमिलिंग में आमतौर पर उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों में, थर्मोप्लास्टिक्स अपने कई अनुकूल गुणों और जैविक अनुप्रयोगोंके साथ संगतता के कारण एक प्रमुख विकल्प बने हुए हैं। थर्मोप्लास्टिक्स माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम के लिए एक आकर्षक सब्सट्रेट हैं क्योंकि कम लागत वाले, डिस्पोजेबल विश्लेषणात्मक प्रणालियोंको विकसित करने के लिए उनके महत्वपूर्ण फायदे हैं। इसके अलावा, ये सामग्रियां उच्च मात्रा वाली विनिर्माण प्रक्रियाओं के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं, जिससे उन्हें व्यावसायीकरण और बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए उपयुक्त बनाया जाता है। इन कारणों से, पीएमएमए जैसे थर्मोप्लास्टिक्स को माइक्रोफ्लुइडिक्स10 के शुरुआती वर्षों से विश्वसनीय और मजबूत सामग्री माना जाता है। थर्मोप्लास्टिक्स में बंद चैनलों को बनाने के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जैसे विलायक बॉन्डिंग15, हीट बॉन्डिंग16, और पराबैंगनी (यूवी)/ओजोन सतह उपचार बॉन्डिंग17।
कई मामलों में, पारंपरिक माइक्रोमिलिंग मशीनों के साथ प्राप्त पोजिशनिंग रिज़ॉल्यूशन कुछ माइक्रोफ्लुइडिक अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त नहीं है जिनके लिए 10 μm से छोटी संरचनाओं की आवश्यकता होती है। हाई-एंड माइक्रोमिलिंग में पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन होता है। दुर्भाग्य से, उच्च कीमतों के कारण, इसका उपयोग मुट्ठीभर उपयोगकर्ताओं तक सीमित है। इससे पहले, हमारे शोध समूह ने कम लागत वाले उपकरण के निर्माण और हेरफेर की सूचना दी थी जो पारंपरिक मिलिंग मशीनों12 के संकल्प पर काबू पाने के लिए 10 μm से कम की मशीनिंग संरचनाओं की अनुमति देता है। फिक्स्चर सरल इलेक्ट्रॉनिक्स के साथ 3 डी प्रिंटिंग द्वारा निर्मित एक मंच है, जिसमें तीन पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर होते हैं। सतह में हिंज के आकार के जोड़ होते हैं जो पीजोइलेक्ट्रिक तत्वों के एक साथ कार्य करने पर इसे उठाने की अनुमति देते हैं। जेड-अक्ष विस्थापन को 500 एनएम के रिज़ॉल्यूशन और ±1.5 μm12 की सटीकता के साथ नियंत्रित किया जा सकता है।
यह पेपर एक माइक्रोमिलिंग तकनीक के माध्यम से ऐक्रेलिक डिवाइस (पीएमएमए) की विनिर्माण प्रक्रिया के चरणों को प्रस्तुत करता है। चिप डिजाइन में अभिकर्मकों के प्रवाह को शुद्ध करने के लिए एक मुख्य चैनल 200 μm चौड़ा और 200 μm ऊंचा और समान आयामों के साथ एक साइड चैनल होता है। मध्य क्षेत्र में, चैनल को केवल 5 μm ऊंचाई के भौतिक प्रतिबंध द्वारा बाधित किया जाता है, जो इस समूह12 द्वारा बनाए गए 3D-मुद्रित पीज़ोइलेक्ट्रिक प्लेटफॉर्म के साथ बनाया गया है, चुंबकीय माइक्रोपार्टिकल्स को पकड़ने के लिए जो बाहरी चुंबक रखकर नैनोकणों के लिए चुंबकीय जाल बनाते हैं। हम 100 एनएम चुंबकीय नैनोकणों के लिए संयुग्मित मॉडल एंटीजन के रूप में लाइसोजाइम का उपयोग करके एक वाणिज्यिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोसे का प्रदर्शन करके माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के संचालन को दिखाते हैं। यह उपकरण विभिन्न विशेषताओं को जोड़ता है जो इसे अद्वितीय बनाते हैं4: प्रतिरक्षा समर्थन के रूप में चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग कुल परीक्षण समय को घंटों से मिनटों तक कम कर देता है; पता लगाने के लिए एक फ्लोरोजेनिक एंजाइम का उपयोग करने से पता लगाने की सीमा ओं की अनुमति मिलती है जो मानक एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (ईएलआईएसए) के बराबर हैं; और एक निर्माण सामग्री के रूप में थर्मोप्लास्टिक का उपयोग इसे बड़े पैमाने पर उत्पादन के साथ संगत बनाता है, जो पिछले माइक्रोफ्लुइडिक नैनोकणों के चुंबकीय जाल3 के लिए मामला नहीं था, और इसे पीओसीटी विकसित करने के लिए एक उत्कृष्ट उम्मीदवार बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इम्यूनोसपोर्ट के रूप में नैनोकणों का उपयोग करके इम्यूनोएसे के लिए एक ऐक्रेलिक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस एक माइक्रोमिलिंग तकनीक का उपयोग करके बनाया गया था। सब्सट्रेट पर प्रत्यक्ष विनिर्माण की विधि मे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को कोनासाइट, मेक्सिको द्वारा “प्रोग्रामा डी एपोयोस पैरा एक्टिविडेड्स साइंटिफिकास, टेक्नोलोगिकास वाई डी इनोवासियोन” के अनुदान 312231 के तहत और एएमईएक्ससीआईडी और मैक्सिकन विदेश संबंध मंत्रालय (एसआरई) द्वारा अनुदान “प्रुएबा सेरोलोगिका रेपिडा, बराटा और डी अल्टा सेंसिबिलिड पैरा सार्स-सीओवी -2” के तहत समर्थित किया गया था। JAHO अपनी पीएचडी छात्रवृत्ति के लिए Conacyt मेक्सिको को धन्यवाद देता है।
Materials
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
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