Summary

Microbroyage à commande numérique par ordinateur d’un dispositif acrylique microfluidique avec restriction échelonnée pour les immunoessais à base de nanoparticules magnétiques

Published: June 23, 2022
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Summary

La microfluidique est un outil puissant pour le développement de tests diagnostiques. Cependant, des équipements et des matériaux coûteux, ainsi que des techniques de fabrication et de manutention laborieuses, sont souvent nécessaires. Ici, nous détaillons le protocole de fabrication d’un dispositif microfluidique acrylique pour les immunoessais magnétiques à base de micro et nanoparticules dans un environnement peu coûteux et simple d’utilisation.

Abstract

Les systèmes microfluidiques ont grandement amélioré les techniques d’immunoessais. Cependant, de nombreuses techniques de microfabrication nécessitent un équipement spécialisé, coûteux ou compliqué, ce qui rend la fabrication coûteuse et incompatible avec la production de masse, ce qui est l’une des conditions préalables les plus importantes pour que les tests au point de service (DPS) soient adoptés dans les milieux à faibles ressources. Ce travail décrit le procédé de fabrication d’un dispositif acrylique (polyméthacrylate de méthyle, PMMA) pour les tests immunologiques enzymatiques conjugués aux nanoparticules à l’aide de la technique de microbroyage à commande numérique par ordinateur (CNC). Le fonctionnement du dispositif microfluidique est démontré en effectuant un dosage immunologique pour détecter un anticorps commercial utilisant le lysozyme comme antigène modèle conjugué à des nanoparticules magnétiques de 100 nm. Ce dispositif intègre une restriction physique échelonnée de seulement 5 μm de hauteur, utilisée pour capturer les microparticules magnétiques qui composent un piège magnétique en plaçant un aimant externe. De cette façon, la force magnétique sur l’immunosupport des nanoparticules conjuguées est suffisante pour les capturer et résister à la traînée d’écoulement. Ce dispositif microfluidique est particulièrement adapté à la production de masse à faible coût sans perte de précision pour les performances des immunoessais.

Introduction

Ces dernières années, la microfluidique a joué un rôle important dans les techniques d’immunoessais1. La technologie de miniaturisation présente de nombreux avantages exceptionnels par rapport aux immunoessais traditionnels, tels qu’une consommation réduite d’échantillons et de réactifs, des temps d’incubation plus courts, un échange de solution efficace et une intégration et une automatisation accrues2.

De plus, les systèmes microfluidiques dans les essais immunologiques, associés à des nanoparticules magnétiques comme immunosupport, réduisent considérablement les temps d’incubation, atteignant une sensibilité de détection élevée en raison de l’augmentation du rapport surface/volume3. Le mouvement brownien des particules améliore la cinétique de réaction lors de la formation du complexe antigène-anticorps 4,5. De plus, les propriétés magnétiques des nanoparticules offrent la polyvalence nécessaire pour être intégrées dans différentes configurations de dispositifs microfluidiques, ce qui en fait un candidat idéal pour la signalisation et la capture de molécules dans les systèmes de biodétection miniaturiséssur puce 5. Cependant, les forces magnétiques sont significativement plus faibles que les forces de traînée à l’échelle nanométrique en raison du rapport surface/volume élevé6. Par conséquent, la capture de nanoparticules pour des étapes cruciales d’immunodosage telles que le lavage et la détection peut être difficile, et un aimant conventionnel est insuffisant4.

Un moyen efficace de manipuler les nanoparticules est l’utilisation d’un piège magnétique microfluidique formé de microparticules de fer, qui sont emballées dans une structure microfluidique3. Par conséquent, lorsqu’un aimant externe s’approche, une interaction complexe est créée dans le milieu poreux magnétisé entre les forces magnétiques et de flux. La force magnétique agissant sur les nanoparticules est suffisamment forte pour les capturer et résister à la traînée d’écoulement 3,4,7. Cette approche nécessite des techniques de microfabrication qui atteignent des résolutions de l’ordre de quelques micromètres pour générer des structures micrométriques qui retiennent les microparticules.

Les techniques actuelles de microfabrication permettent la fabrication à haute résolution de structures allant de quelques microns à des centaines de nanomètres8. Cependant, bon nombre de ces techniques nécessitent un équipement spécialisé, coûteux ou compliqué. L’une des principales difficultés est la nécessité d’une salle blanche pour la fabrication des moules, qui reste coûteuse et chronophage 8,9. Récemment, les ingénieurs en microfluidique ont surmonté cet inconvénient en développant une variété de méthodes de fabrication alternatives, avec divers avantages tels que des coûts réduits, des délais d’exécution plus rapides, des matériaux et des outils moins chers et des fonctionnalités accrues8. De cette façon, le développement de nouvelles techniques de microfabrication a apporté des méthodes peu coûteuses, non salles blanches, qui atteignent des résolutions aussi basses que 10 μm8. Le modelage peut être utilisé directement sur un substrat sans générer un motif de moulage coûteux, évitant ainsi un processus fastidieux. Les méthodes de fabrication directe comprennent le fraisage CNC, l’ablation laser et la lithographie directe8. Toutes ces méthodes sont adaptées à la production de canaux à rapport d’aspect élevé dans une large gamme de matériaux, quelle que soit leur dureté9, permettant des géométries, des comportements physiques et des qualités nouveaux et avantageux dans les dispositifs microfluidiques8.

Le microfraisage CNC crée des structures à l’échelle microscopique à l’aide d’outils de coupe qui éliminent le matériau en vrac d’un substrat et constitue une méthode de fabrication efficace pour les dispositifs microfluidiques10,11. La technique de microfraisage peut être utile dans les applications microfluidiques pour créer des microcanaux et des caractéristiques directement sur la surface de travail, offrant un avantage clé : une pièce peut être fabriquée en peu de temps (moins de 30 min), ce qui réduit considérablement le délai d’exécution entre la conception et le prototype12. En outre, la grande disponibilité d’accessoires de coupe de différents matériaux, tailles et formes fait des fraiseuses CNC un outil approprié qui a permis la fabrication de différentes caractéristiques dans de nombreux types de matériaux jetables à faible coût13.

Parmi tous les matériaux couramment utilisés dans le microbroyage, les thermoplastiques restent un choix de premier plan en raison de leurs nombreuses propriétés favorables et de leur compatibilité avec les applications biologiques10,14. Les thermoplastiques sont un substrat attrayant pour les systèmes microfluidiques en raison de leurs avantages significatifs pour le développement de systèmes analytiques jetables à faible coût9. En outre, ces matériaux se prêtent très bien aux processus de fabrication à grand volume, ce qui les rend adaptés à la commercialisation et à la production de masse. Pour ces raisons, les thermoplastiques tels que le PMMA sont considérés comme des matériaux fiables et robustes depuis les premières années de la microfluidique10. Différents protocoles ont été décrits pour fabriquer des canaux fermés dans les thermoplastiques, tels que le collage par solvant15, le collage thermique 16 et le collage de surface ultraviolet (UV)/ozone17.

Dans de nombreux cas, la résolution de positionnement obtenue avec les microfraiseuses conventionnelles n’est pas suffisante pour certaines applications microfluidiques nécessitant des structures inférieures à 10 μm. Le microfraisage haut de gamme a une résolution suffisante. Malheureusement, en raison des prix élevés, son utilisation est limitée à une poignée d’utilisateurs12. Auparavant, notre groupe de recherche a rapporté la fabrication et la manipulation d’un outil à faible coût qui permet d’usiner des structures de moins de 10 μm, surmontant la résolution des fraiseuses conventionnelles12. Le luminaire est une plate-forme fabriquée par impression 3D avec une électronique simple, contenant trois actionneurs piézoélectriques. La surface contient des joints en forme de charnière qui permettent de la soulever lorsque les éléments piézoélectriques agissent simultanément. Le déplacement de l’axe Z peut être contrôlé avec une résolution de 500 nm et une précision de ±1,5 μm12.

Cet article présente les étapes du processus de fabrication d’un dispositif acrylique (PMMA) à travers une technique de microfraisage. La conception de la puce se compose d’un canal principal de 200 μm de large et 200 μm de haut et d’un canal latéral avec les mêmes dimensions pour purger le flux des réactifs. Dans la région centrale, le canal est interrompu par une restriction physique de seulement 5 μm de hauteur, fabriquée avec la plate-forme piézoélectrique imprimée en 3D réalisée par ce groupe12, pour capturer les microparticules magnétiques qui constituent un piège magnétique pour les nanoparticules en plaçant un aimant externe. Nous montrons le fonctionnement du dispositif microfluidique en effectuant un dosage immunologique pour détecter un anticorps commercial en utilisant le lysozyme comme antigène modèle conjugué à des nanoparticules magnétiques de 100 nm. Ce dispositif combine différentes caractéristiques qui le rendent unique4: l’utilisation de nanoparticules magnétiques comme support immunitaire réduit le temps total de test de quelques heures à quelques minutes; l’utilisation d’une enzyme fluorogénique pour la détection permet d’obtenir des limites de détection comparables à celles des tests immuno-enzymatiques standard (ELISA); et l’utilisation d’un thermoplastique comme matériau de fabrication le rend compatible avec la production de masse, ce qui n’était pas le cas pour les précédents pièges magnétiques de nanoparticules microfluidiques3, et en fait un excellent candidat pour développer le POCT.

Protocol

1. Microfraisage Rectification de surfaceAllumez la microfraiseuse et le contrôleur piézoélectrique. Démarrez leur logiciel de contrôle respectif12. Sélectionnez les taillants d’extrémité requis (diamètres 200 μm et 800 μm). Placez-les dans le compartiment approprié de la fraiseuse (Figure 1). Découpez des rectangles de 9 mm x 25 mm en PMMA de 1,3 mm d’épaisseur avec le taillant d’extrémité…

Representative Results

Il a été possible d’établir un protocole de fabrication hautement reproductible qui améliore la résolution de la technique de microfraisage conventionnelle. En utilisant ce protocole, la fabrication d’un canal aussi petit que 5 μm de hauteur qui fonctionne comme une restriction échelonnée dans un canal de 200 μm de haut est réalisée. La conception simple de la restriction décalée capture les microparticules de fer de 7,5 μm de diamètre qui, lorsqu’elles sont compactées dans le microcanal, permettent…

Discussion

Un dispositif microfluidique acrylique pour des dosages immunologiques utilisant des nanoparticules comme immunosupport a été fabriqué à l’aide d’une technique de microbroyage. La méthode de fabrication directe sur le substrat a l’avantage d’éviter l’utilisation d’un moule maître et le temps et les coûts que cela implique. Cependant, il est limité au prototypage rapide et à la fabrication de dispositifs à haut volume.

Ici, nous avons utilisé une plate-forme piézoélect…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par Conacyt, Mexique dans le cadre de la subvention 312231 du « Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación », et par l’AMEXCID et le Ministère mexicain des relations extérieures (SRE) sous la subvention « Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2 ». JAHO remercie Conacyt Mexico pour sa bourse de doctorat.

Materials

0.008 Endmill KYOCERA SGS  2204 2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12
0.032 Endmill KYOCERA SGS  2228 2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12
Carbonyl-iron microparticles  Sigma-Aldrich 44890 7 μm 
Chloroform Fermont 6201 Health Hazard: Moderate
Flammability: None
Reactivity: None
Contact Hazard: Moderate 
CMOS camera Moment Teledyne Photometrics Sensor Technology: CMOS
Quantum Efficiency: 73%
Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm
Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software Roland DGA Corporation Engraving software to design and create the engraving path on the surface
Extraction hood Unknown Unknown
Flexible Plastic Tubing Tygon AAD04103 ID = 0.020, OD = 0.060
Fluorescence microsope  ZEISS Axio Vert.A1
High Precision Dispense Needle Loctite 98612
Homemade piezoelectric controller application LabView  See reference 12 for more details.
Loctite 495 instant adhesive Henkel 49503 Apply with micropipette tip or dispensing needle 
MagJET Separation Rack thermoscientific 12 x 1.5 mL
Mechanic press Home-made
Milling Machine Roland MDX-50
Piezoelectric platform  Home-made See reference 12
Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic Goodfellow ME303018/1 Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent
PVCamTest software Teledyne Photometrics Version 3.10.107  Image acquisition software
Stereo microscope Nikon SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads Ocean NanoTech KSC0100 100 nm
Syringe pump kd Scientific  KDS200 Can hold up to two syringes
Utrasonic bath Branson 2800
VPanel software  Windows OS Version 1.0.3.0 Software for controlling the micromilling machine

References

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Hernández-Ortiz, J. A., Guevara-Pantoja, P. E., Andrade-Medina, M., Carrillo-Tripp, M., Caballero-Robledo, G. A. Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays. J. Vis. Exp. (184), e63899, doi:10.3791/63899 (2022).

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