Leeftijdsgebonden gehoorverlies is een van ‘s werelds meest voorkomende ziekten die meer dan een derde van de wereldbevolking van 65 jaar en ouder^{treft 1}. De onderliggende oorzaken zijn nog steeds in discussie en worden actief onderzocht, maar kunnen het verlies van de gespecialiseerde synapsen omvatten die binnenste haarcellen (IHC’s) verbinden met afferente gehoorzenuwvezels². Deze lintsynapsen bestaan uit een presynaptische structuur met blaasjes gevuld met de neurotransmitter glutamaat eraan vastgebonden, evenals postsynaptische α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionzuur (AMPA) glutamaatreceptoren ^3,4,5. In de gerbil komen ~20 afferente gehoorzenuwvezels in contact met één IHC ^6,7,8. Vezels op de IHC tegenover de modiolus zijn in tegenstelling tot grote synaptische linten, terwijl de vezels die aan de pijlerzijde van de IHC verbinden, kleine synaptische linten tegenkomen (d.w.z. bij katten⁹, gerbils⁷, cavia’s¹⁰ en muizen 3,11,12,13,14). Bovendien zijn in de gerbil de grootte van de presynaptische linten en de postsynaptische glutamaatpleisters positief gecorreleerd ^7,14. Vezels die zich verzetten tegen grote linten aan de modiolaire kant van de IHC zijn klein van kaliber en hebben lage spontane snelheden en hoge drempels¹⁵. Er zijn aanwijzingen dat vezels met een lage spontane snelheid kwetsbaarder zijn voor blootstelling aan lawaai¹⁰ en ototoxische geneesmiddelen¹⁶ dan hoog-spontane laagdrempelige vezels, die zich aan de pijlerzijde van IHC’s¹⁵ bevinden.

Het verlies van lintsynapsen is de vroegste degeneratieve gebeurtenis in cochleair neuraal leeftijdsgebonden gehoorverlies, terwijl het verlies van spiraalvormige ganglioncellen en hun afferente gehoorzenuwvezels achterblijft bij^17,18. Elektrofysiologische correlaten omvatten opnames van auditieve hersenstamresponsen¹⁷ en samengestelde actiepotentialen⁸; deze weerspiegelen echter niet de subtiliteiten van synapsverlies, omdat vezels met een lage spontane snelheid niet bijdragen aan deze metingen¹⁶. Meer veelbelovende elektrofysiologische metrieken zijn de massapotentiaal-afgeleide neurale index¹⁹ en de peristimulus-tijdrespons²⁰. Deze zijn echter alleen betrouwbaar als het dier geen andere cochleaire pathologieën heeft, naast verlies van gehoorzenuwvezels, die de activiteit van de resterende gehoorzenuwvezels beïnvloeden⁸. Bovendien waren gedragsmatig beoordeelde drempels in de gerbil niet gecorreleerd met synapsgetallen²¹. Daarom is betrouwbare kwantificering van overlevende lintsynapsen en dus het aantal functionele gehoorzenuwvezels alleen mogelijk door direct onderzoek van het cochleaire weefsel.

De Mongoolse gerbil (Meriones unguiculatus) is een geschikt diermodel voor het bestuderen van leeftijdsgebonden gehoorverlies. Het heeft een korte levensduur, heeft een laagfrequent gehoor vergelijkbaar met mensen, is gemakkelijk te onderhouden en vertoont overeenkomsten met menselijke pathologieën gerelateerd aan leeftijdsgebonden gehoorverlies 2,22,23,24. Gerbils worden als oud beschouwd wanneer ze 36 maanden oud zijn, wat bijna het einde van hun gemiddelde levensduur²² is. Belangrijk is dat een leeftijdsgebonden verlies van lintsynapsen is aangetoond bij gerbils die zijn opgevoed en verouderd in rustige omgevingen ^8,21.

Hier wordt een protocol gepresenteerd om slakkenhuis van gerbils van verschillende leeftijden, van jongvolwassenen tot oud, te labelen, te ontleden en te analyseren. Antilichamen gericht tegen componenten van de presynapse (CtBP2), postsynaptische glutamaatreceptorpleisters (GluA2) en IHC’s (myoVIIa) worden gebruikt. Er wordt een autofluorescentie quencher toegepast die de achtergrond in verouderd slakkenhuis vermindert en het fluorescentiesignaal intact laat. Verder wordt een beschrijving gegeven van hoe het slakkenhuis te ontleden om zowel het sensorische epitheel als de stria vascularis te onderzoeken. De cochleaire lengte wordt gemeten om de selectie van verschillende cochleaire locaties mogelijk te maken die overeenkomen met specifieke beste frequenties²⁵. Kwantificering van synapsnummers wordt uitgevoerd met de vrij beschikbare software ImageJ²⁶. Aanvullende kwantificering van synapsvolumes en locaties binnen de individuele HC wordt uitgevoerd met software die op maat is geschreven in Matlab. Deze software wordt niet openbaar gemaakt, omdat de auteurs niet over de middelen beschikken om professionele documentatie en ondersteuning te bieden.