Sinpses de fita de imunolabeling e contagem em jovens adultos e cócleas de Gerbil Envelhecido

A perda auditiva relacionada à idade é uma das doenças mais prevalentes do mundo que afeta mais de um terço da população mundial com 65 anos ou^{mais de 1 ano}. As causas subjacentes ainda estão em debate e estão sendo investigadas ativamente, mas podem incluir a perda das sinapses especializadas que conectam células ciliadas internas (IHCs) com diferentes fibras nervosas auditivas². Estas sinapses de fita compreendem uma estrutura pré-sináptica que tem vesículas preenchidas com o glutamato neurotransmissor amarrado a ele, bem como receptores de glutamato α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic ácido (AMPA)^{receptores de} glutamato ^3,4,5. No gerbil, ~20 fibras nervosas auditivas diferentes entram em contato com um IHC ^6,7,8. As fibras no IHC voltadas para o modiólus se opõem a grandes fitas sinápticas, enquanto as fibras que se conectam no lado do pilar do IHC enfrentam pequenas fitas sinápticas (ou seja, em gatos⁹, gerbils⁷, cobaias¹⁰ e ratos 3,11,12,13,14). Além disso, no gerbil, o tamanho das fitas pré-sinápticas e as manchas de glutamato postsintáptico estão correlacionados positivamente ^7,14. As fibras que se opõem a grandes fitas no lado modiolar do IHC são pequenas de calibre e têm baixas taxas espontâneas e limiares elevados¹⁵. Há evidências de que as fibras de baixa taxa espontânea são mais vulneráveis à exposição ao ruído¹⁰ e drogas ototóxias¹⁶ do que fibras de baixo limiar espontâneos, que estão localizadas no lado pilar dos IHCs¹⁵.

A perda de sinapses de fita é o mais antigo evento degenerativo na perda auditiva relacionada à idade neural coclear, enquanto a perda de células de gânglio espiral e suas diferentes fibras nervosas auditivas fica atrás^{de 17,18}. Correlações eletrofisiológicas incluem gravações de respostas auditivas do tronco^{cerebral 17} e potenciais de ação composta⁸; entretanto, não refletem as sutilezas da perda de sinapse, uma vez que as fibras de baixa taxa espontânea não contribuem para essas medidas¹⁶. Métricas eletrofisiológicas mais promissoras são o índice neural derivado de massa¹⁹ e a resposta ao tempo peristimulus²⁰. No entanto, estes só são confiáveis se o animal não tiver outras patologias cocleares, além da perda auditiva de fibras nervosas, que afetam a atividade das fibras nervosas auditivas restantes⁸. Além disso, os limiares avaliados comportamentalmente no gerbil não foram correlacionados com os números da sinapse²¹. Portanto, a quantificação confiável das sinapses de fita sobreviventes e, assim, o número de fibras nervosas auditivas funcionais só é possível mediante o exame direto do tecido coclear.

O gerbil mongol (Meriones unguiculatus) é um modelo animal adequado para estudar a perda auditiva relacionada à idade. Tem uma vida útil curta, tem audição de baixa frequência semelhante aos humanos, é fácil de manter, e mostra semelhanças com patologias humanas relacionadas à perda auditiva relacionada à idade 2,22,23,24. Os gerbils são considerados idosos quando chegam aos 36 meses de idade, o que está perto do fim de sua média de vida²². É importante ressaltar que uma perda relacionada à idade das sinapses de fita tem sido demonstrada em gerbils criados e envelhecidos em ambientes tranquilos ^8,21.

Aqui, é apresentado um protocolo para imunolabel, dissecar e analisar cócleas de gerbils de diferentes idades, de adultos jovens a idosos. Anticorpos direcionados contra componentes da presinapse (CtBP2), patches de receptor de glutamato postânaptic (GluA2) e IHCs (myoVIIa). Aplica-se um quencher de autofluorescência que reduz o fundo em cóclea envelhecida e deixa o sinal de fluorescência intacto. Além disso, é dada uma descrição de como dissecar a cóclea para examinar tanto o epitélio sensorial quanto a estria vascularis. O comprimento coclear é medido para permitir a seleção de locais cocleares distintos que correspondem às melhores frequências específicas²⁵. A quantificação dos números da sinapse é realizada com o software disponível livremente ImageJ²⁶. A quantificação adicional de volumes e locais de sinapse dentro do HC individual é realizada com software personalizado escrito no Matlab. Este software não é disponibilizado publicamente, pois os autores não têm recursos para fornecer documentação profissional e suporte.