Summary

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של מיקרו-סירקולציה ריאתית בפגיעה חריפה ניסיונית של הריאות באמצעות מערכת הדמיה מיוצבת ואקום

Published: April 06, 2022
doi:

Summary

ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית כדי לחקור אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וזלוף נימי בזמן אמת. פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמות ולכמת פרמטרים אלה במיקרו-סירקולציה ריאתית באמצעות מערכת הדמיית ריאות המיוצבת בריק.

Abstract

הדמיה תוך-ורידית של אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל מציעה תובנות חשובות על מחלות בתיווך מערכת החיסון בבעלי חיים. המחקר של פגיעה חריפה בריאות (ALI)/תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) ופתולוגיות נשימתיות אחרות in vivo הוא קשה בשל הנגישות המוגבלת וממצאי התנועה המובנים של הריאות. עם זאת, פותחו גישות שונות כדי להתגבר על אתגרים אלה. פרוטוקול זה מתאר שיטה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית לחקר אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל בזמן אמת במיקרו-סירקולציה ריאתית במודל ניסיוני של ALI. מערכת הדמיית ריאות in vivo ופלטפורמת מיקרוסקופיה תוך-ורידית מודפסת בתלת-ממד משמשות לאבטחת העכבר המרדים ולייצב את הריאה תוך מזעור פגיעה מבלבלת של הריאות. לאחר ההכנה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב משמשת לחקר הידבקות לויקוציטים, גלגול לויקוציטים ותפקוד נימי. בעוד שהפרוטוקול המוצג כאן מתמקד בהדמיה במודל אקוטי של מחלת ריאות דלקתית, הוא עשוי להיות מותאם גם לחקר תהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים אחרים בריאה.

Introduction

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) היא כלי הדמיה שימושי להדמיה וחקר של תהליכים ביופיזיים שונים in vivo. הריאה מאתגרת מאוד לצילום in vivo בשל מיקומה הסגור, האופי השברירי של הרקמה שלה וממצאי תנועה המושרים על ידי נשימה ודופק 1,2. תצורות מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) שונות פותחו להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל במיקרו-סירקולציה ריאתית כדי להתגבר על אתגרים אלה. גישות כאלה מבוססות על חשיפה כירורגית וייצוב של הריאה לצורך הדמיה.

בעלי חיים מוכנים בדרך כלל להפריה חוץ גופית של הריאות בהליכים כירורגיים. ראשית, בעלי חיים הם intubated ומאוורר, אשר מאפשר כריתה כירורגית של חלון בית החזה והתערבויות לאחר מכן כדי לייצב את הריאה להדמיה. טכניקה אחת כוללת הדבקת הפרנצ’ימה על כיסוי זכוכית3, הליך המסתכן בטראומה פיזית משמעותית לרקמה המצולמת. מתקדם יותר הוא השימוש במערכת ואקום לייצוב הריאה מתחת לחלון זכוכית4. מערך זה מאפשר היצמדות רופפת של פני הריאה לכיסוי באמצעות ואקום הפיך המתפשט על פני שטח מקומי גדול ומרחיב את הריאה תוך הגבלת התנועה בממדים x, y ו-z4. הוואקום מוחל באופן שווה דרך תעלה המקיפה את אזור ההדמיה של המערך ומושך את הרקמה לאזור חרוטי רדוד הפונה לכיסוי ברמת הדמיה4. דרך חלון צפייה זה, ניתן לחקור את המיקרו-סירקולציה של הריאות באמצעות שיטות הדמיה אופטיות שונות.

Lung IVM מאפשר הדמיה כמותית של מספר רב של פרמטרים מיקרו-מעגליים. אלה כוללים מדידות כגון מהירות ואורך מסלול לויקוציטים5, מהירות זרימת תאי דם אדומים6 וחמצון7, גרורות גידול8, הבחנה בין תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון 9,10,11, הדמיה של מיקרו-חלקיקים12, דינמיקה של נאדיות13,14, חדירות כלי דם15 ותפקוד נימי16 . ההתמקדות כאן היא בגיוס לויקוציטים ותפקוד נימי. התחלת גיוס לויקוציטים במיקרו-סירקולציה ריאתית כוללת אינטראקציות גלגול חולפות ואינטראקציות דבקות מוצקות בין לויקוציטים לתאי אנדותל, שניהם מוגברים בתנאים דלקתיים16,17. בדרך כלל, גלגול הוא כימות על ידי מספר לויקוציטים העוברים קו ייחוס המוגדר על ידי מפעיל, בעוד הידבקות מכמתת על ידי מספר לויקוציטים שאינם תנועה על האנדותל16. תפקוד נימי עשוי להיות מושפע גם במצבים דלקתיים, לעתים קרובות וכתוצאה מכך ירידה בזלוף. ניתן לייחס זאת למספר גורמים, כולל הפחתה של עיוות תאי דם אדומים18 וביטוי מגוון של NO synthase inducible על ידי תאי אנדותל וכתוצאה מכך shunting פתולוגי19. בדרך כלל, האורך המצטבר של נימים מחוררים לכל אזור נמדד ומדווח כצפיפות נימי תפקודית (FCD).

חקר גיוס לויקוציטים בריאות בזמן אמת דורש תיוג מטרות ביולוגיות בצבעים פלואורסצנטיים או בנוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית20. לחלופין, ניתן להשתמש בזני עכברים מהונדסים שונים כגון lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) עכברים כדי לצלם תת-קבוצות ספציפיות של תאי מערכת החיסון כגון נויטרופילים21,22. לאחר מכן ניתן לדמיין את הלויקוציטים בעלי התווית הפלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב, מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופיית מולטיפוטונים. טכניקות אלה משיגות ניגודיות על ידי שימוש באורכי גל ספציפיים של עירור וגילוי פלואורסצנציה הנפלטת תוך חסימת זיהוי אורך הגל של העירור, ובכך מדגישות את האובייקט המסומן.

מחקרים קיימים הנוגעים לכימות גלגול לויקוציטים, הידבקות וצפיפות נימים תפקודית בריאת מורין הסתמכו בעיקר על ניתוח וידאו ידני. זה מתאפשר באמצעות תוכנות קוד פתוח כגוןFiji 6,23, תוכנה קניינית כגון CapImage12, או מערכות עיבוד תמונה מותאמות אישית24. לעומת זאת, פלטפורמות תוכנה קנייניות שונות (למשל, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) מאפשרות מדידה אוטומטית של מגוון רחב של פרמטרים פיזיולוגיים אחרים, כולל רבים מאלה שהוזכרו כאן קודם לכן 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

נעשו תצפיות חשובות לגבי הפתולוגיה של פגיעה חריפה בריאה (ALI) ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) באמצעות IVM ריאה. ARDS מאופיין בשורה של תהליכים פתופיזיולוגיים בריאה, כולל בצקת ריאות ונזק נאדי הנגרם על ידי תפקוד לקוי של מחסום האנדותל והאפיתל25. באמצעות מודל מורין, נמצא כי ALI המושרה על ידי אלח דם קשור לשינויים מזיקים משמעותיים בסחר בתאי מערכת החיסון בסביבת הריאות26. נויטרופילים שגויסו לנימים של עכברים עם ALI המושרה על ידי אלח דם נמצאו כמעכבים מיקרו-סירקולציה, ובכך מגבירים את ההיפוקסיה ב-ALI26. בנוסף, IVM שימש כדי לקבל תובנות לגבי המנגנון הבסיסי של תיקון לאחר הופעת ARDS27. Lung IVM היה גם כלי רב ערך בהבנת שינויים פתופיזיולוגיים במחלות ריאה חסימתיות שונות. לדוגמה, הדמיה של הובלת ריר במחלות כגון סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) אפשרה את המחקר של טיפולים חדשניים וקיימים לפינוי ריריות28. סחר בלוקוציטים בתנאים אלה נותח גםכן 17.

פרוטוקול זה מרחיב את הגישה שתוארה לראשונה על ידי Lamm et al.29 לחקר אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. הפרוצדורות המתוארות משתמשות במערכת הדמיית ריאות in vivo, הכוללת בסיס מתכת בגודל 16.5 ס”מ על 12.7 ס”מ, מיקרומניפולטור וחלון הדמיית ואקום (איור 1). המערכת מותקנת על פלטפורמה מודפסת תלת-ממדית בגודל 20 ס”מ על 23.5 ס”מ (קובץ משלים 1) כדי לספק חיבור מאובטח לצינורות האוורור ולמשטח החימום. שיטה זו מציעה הדמיה ניתנת לשחזור ולכימות של מיקרו-סירקולציה ריאתית של מורין in vivo. היבטים חשובים של ההכנה הכירורגית, כמו גם ניצול נכון של מערכת הדמיית ריאות מיוצבת ואקום מוסברים בפירוט. לבסוף, מודל ניסיוני של ALI משמש כדי לספק הדמיה ייצוגית וניתוח של גלגול לויקוציטים שהשתנה, הידבקות לויקוציטים וזלוף נימי הקשור לדלקת. השימוש בפרוטוקול זה אמור להקל על חקירות חשובות נוספות של שינויים פתופיזיולוגיים במיקרו-סירקולציה ריאתית במהלך מצבי מחלה חריפים.

Protocol

כל ההליכים המתוארים כאן בוצעו באישור מראש של הוועדה של אוניברסיטת דלהאוזי למען חיות מעבדה (UCLA). 1. הכנה מערכת הדמיית ריאות: כדי להכין את החלון, תנו שכבה דקה של שומן ואקום לחלק העליון של הטבעת החיצונית תוך הימנעות מזיהום של תעלת הוואקום. מניחים כיסוי זכוכית נקי ב?…

Representative Results

כדי להמחיש את התוצאות הניתנות להשגה באמצעות פרוטוקול זה, נגרמה פגיעה חריפה בריאה (ALI) 6 שעות לפני ההדמיה באמצעות מודל של החדרת ליפופוליסכריד חיידקי תוך-ורידי (LPS). בקצרה, עכברים (n = 3) הורדמו עם איזופלורן, וטיפות קטנות של LPS מ – Pseudomonas aeruginosa במי מלח סטריליים (10 מ”ג / מ”ל) הוכנסו לתוך הנריס השמאל…

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן דורש תרגול ותשומת לב לכמה שלבים קריטיים. ראשית, חשוב להכין את חלון ההדמיה לפני תחילת האינטובינציה והניתוח. השתמשו בכמות מינימלית של שומן ואקום כדי לצפות את הטבעת החיצונית של חלון ההדמיה, למרוח את זכוכית הכיסוי ולבדוק את היניקה עם טיפת מים מזוקקים. הכנה זו מראש תמנע מהרי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לד”ר פינה קולארוסו, שסיפקה מומחיות משמעותית בעריכה ובתיקון של כתב יד זה.

Materials

1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use Becton, Dickinson and Company 309659 1 mL syringe
ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm RWD Life Science Co. F12002-12 Blunt forceps
Albumin-Fluorescein Isothiocyanate Sigma-Aldrich A9771-1G FITC-albumin
Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v Canadian Custom Packaging Company 80002455 Alcohol wipe
AVDC110 Advanced Digital Video Converter Canopus 00631069602029 Digital video converter
B/W – CCD – Camera Horn Imaging BC-71 Camera
Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit Fine Science Tools 18010-00 Cauterizer
C57BL/6 Mice Charles River Laboratories International C57BL/6NCrl C57BL/6 Mice
Cotton Tipped Applicators Puritan 806-WC Cotton applicator
CS-8R 8mm Round Glass Coverslip Warner Instruments 64-0701 Glass coverslip
Digital Pressure Gauge ITM Instruments Inc. DG2551L0NAM02L0IM&V Digital Pressure Gauge
Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope Dr. Mom Otoscopes 1001 Otoscope
Ethyl Alchohol 95% Vol Commercial Alcohols P016EA95 95% ethanol
Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel Fine Science Tools 14094-11 Scissors
Fisherbrand Colored Labeling Tape Fisher Scientific 1590110 Labeling tape
Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump Cole-Parmer Canada Company ZA-07061-40 Vacuum pump
Hartman Hemostats Fine Science Tools 13003-10 Hemostatic forceps
High Vacuum Grease Dow Corning DC976VF Vacuum grease
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2 Isoflurane
LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL Teligent Canada 0121AD01 Lidocaine HCl 1%
Lung SurgiBoard Luxidea, Inc. IMCH-0001 Designed for intravital microscopy of the lung
Mineral Oil Teva Canada 00485802 Mineral oil
Mouse Endotracheal Intubation Kit Kent Scientific Corporation ETI-MSE Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable
MST49 Fluorescence Microscope Leica Microsystems 10 450 022 Fluorescence Microscope
N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective Leica Microsystems 566035 20x objective
Non-Woven Sponges 2" x 2" AMD-Ritmed A2101-CH Gauze
Optixcare Eye Lube Plus Aventix 5914322 Tear gel
Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer Prusa Research PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI 3D printer
Oxygen, Compressed Linde Canada Inc. Oxygen
PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) Becton, Dickinson and Company 305106 30 G needle
Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL Cole-Parmer Canada Company 5340-2L Vacuum flask
Rhodamine 6 G Sigma-Aldrich 252433 Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" Primed PM5-630709 Cloth tape
Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD Dow Corning 602-205 1.0 mm I.D. polyethylene tubing
Somnosuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific Corporation SS-01, SS-04-module Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter
Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth World Precision Instruments 501216 Toothed forceps
Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) 3M 7000002795 Medical tape
Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. Grainger Canada USSZUSA-HT3314 1.0 cm I.D. polyethylene tubing
Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm Cole-Parmer Canada Company 6720-5002 Inline 0.2µm filter

References

  1. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
  2. Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
  3. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  4. Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
  5. Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
  6. Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
  7. Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
  8. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
  9. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  10. Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
  11. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
  12. Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
  13. Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
  14. Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
  15. Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
  16. Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
  17. Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
  18. Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
  19. Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
  20. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  21. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  22. Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  25. Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
  26. Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
  27. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
  28. Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
  29. Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  30. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  31. Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
  32. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).

Play Video

Cite This Article
Hall, S., Faridi, S., Euodia, I., Tanner, S., Chojnacki, A. K., Patel, K. D., Zhou, J., Lehmann, C. Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System. J. Vis. Exp. (182), e63733, doi:10.3791/63733 (2022).

View Video