Summary

Generazione di cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico

Published: August 31, 2022
doi:

Summary

Descriviamo un protocollo per l’isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e la loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico.

Abstract

L’esplorazione del potenziale terapeutico delle cellule staminali mesenchimali dipende dalla facilità di isolamento, dalla potenza verso la differenziazione e dall’affidabilità e dalla robustezza della fonte. Descriviamo qui un protocollo graduale per l’isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano (uMSCs), la loro immunofenotipizzazione e la propagazione di tali colture su diversi passaggi. In questa procedura, la vitalità degli uMSC è elevata perché non vi è alcuna digestione enzimatica. Inoltre, la rimozione dei vasi sanguigni, comprese le arterie del cordone ombelicale e la vena, assicura che non vi sia contaminazione delle cellule di origine endoteliale. Utilizzando la citometria a flusso, le uMSC all’isolamento sono CD45CD34, indicando un’assenza di cellule dalla linea ematopoietica. È importante sottolineare che esprimono marcatori di superficie chiave, CD105, CD90 e CD73. Al momento della creazione di colture, questo documento descrive un metodo efficace per indurre la differenziazione in queste uMSC nel lignaggio del muscolo scheletrico. Un’analisi dettagliata della progressione miogenica nelle uMSC differenziate rivela che le uMSC esprimono Pax7, un marker per i progenitori miogeni nelle fasi iniziali della differenziazione, seguito dall’espressione di MyoD e Myf5 e, infine, un marcatore di differenziazione terminale, la catena pesante della miosina (MyHC).

Introduction

Il cordone ombelicale umano è stato accreditato per possedere un robusto serbatoio di cellule staminali mesenchimali, che sono attualmente in fase di esplorazione per terapie rigenerative a causa dei loro robusti tassi di proliferazione e differenziazione, proprietà immunomodulatorie e capacità di generare cellule da tutti e tre gli strati germinali1. Il tessuto del cordone ombelicale è costituito da più compartimenti come il sangue del cordone ombelicale, il subendotelio della vena ombelicale e la gelatina di Wharton (WJ), che di per sé comprende tre regioni indistinte: la zona perivascolare, la zona intervascolare e il sub-amnione o il rivestimento del cordone (CL)2. Mentre gli uMSC possono essere isolati da tutte queste diverse regioni ed esprimere ampiamente i marcatori MSC chiave, non c’è chiarezza sul fatto che questi compartimenti contengano la stessa popolazione di uMSC o mostrino differenze nelle loro potenze di differenziazione3. Pertanto, i protocolli per l’isolamento delle uMSC richiedono una maggiore precisione nella loro modalità e regione di isolamento, la robusta caratterizzazione dei potenziali di differenziazione e, infine, un’analisi comparativa da diversi compartimenti del cavo.

In questo contesto, pochi studi hanno dimostrato differenze nei potenziali proliferativi e differenziativi uMSC tra le diverse parti del cavo. Di queste, le analisi comparative tra uMSC isolate dalle regioni CL e WJ hanno rivelato un maggiore potenziale proliferativo nelle UMSC derivate da CL 3,4. In uno studio separato, le uMSC derivate da WJ hanno ottenuto risultati migliori nei saggi di proliferazione rispetto alle cellule perivascolari (HUCPV)5. Nell’esaminare le differenze tra le uMSC derivate dal sangue cordonale e le uMSC derivate dal tessuto cordonale prive di contaminazione vascolare, è stata riportata un’espressione differenziale dei marcatori MSC chiave tra i due compartimenti, nonché un aumento dei tassi di proliferazione nelle uMSC derivate dal tessuto cordonale6.

Dei numerosi studi che esaminano i potenziali di differenziazione delle uMSC principalmente nei tessuti del lignaggio mesodermico come i lignaggi osteogenici, adipogenici e condrogeni, pochissimi hanno fornito protocolli dettagliati per la differenziazione miogenica e la successiva caratterizzazione, nonché analisi comparative tra vari compartimenti del cordone ombelicale. In questo contesto, abbiamo sviluppato un robusto protocollo di differenziazione muscolare e osservato che le uMSC derivate dal tessuto cordonale mostrano capacità di differenziazione miogenica superiori rispetto al sangue del cordone ombelicale6. Qui, un protocollo graduale è dettagliato per l’isolamento delle uMSC dall’intero tessuto cordonale privo di cellule associate alla vascolarizzazione, alla loro caratterizzazione e alla loro differenziazione nel lignaggio miogenico.

Protocol

L’uso del tessuto del cordone ombelicale in questo studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la ricerca sulle cellule staminali (IC-SCR), dal Comitato etico istituzionale, dall’Istituto di scienza e tecnologia della salute traslazionale (IEC-THSTI), dal Comitato etico istituzionale dell’ospedale civile, Gurugram, Haryana e dal Comitato istituzionale per la biosicurezza, THSTI. Campioni di tessuto cordonale umano sono stati raccolti da parti a termine al momento della nascita. Il consenso scritto informato …

Representative Results

Il successo dell’isolamento delle uMSC dal tessuto del cordone ombelicale è >95%, a differenza degli scarsi tassi di successo del sangue del cordone ombelicale intero. Dopo aver isolato con successo le uMSC, l’analisi FACS rivela che tutte le cellule sono CD34−CD45−CD105+CD90+. Tuttavia, in analisi comparativa, le uMSC isolate dal sangue del cordone ombelicale mostrano popolazioni eterogenee, in cui una percentuale di cellule mostra CD34 + CD45 + CD10…

Discussion

Passaggi critici
Un passaggio critico in questo protocollo è la raccolta del tessuto in condizioni asettiche, dal momento della consegna al mantenimento di colture sterili, per l’intera durata della propagazione. Durante la raccolta del cavo, è essenziale che il cavo non tocchi alcuna superficie non sterilizzata e venga tamponato esternamente con etanolo al 70% prima della raccolta in tubi contenenti PBS integrati con antibiotici. È importante limitare il tempo tra la raccolta del cordone e l’elabo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il signor Ojas Tikoo per il loro aiuto con le riprese e la produzione video. Riconosciamo anche l’aiuto ricevuto dal personale GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India), infermieri e funzionari di ricerca senior presso il Gurugram Civil Hospital e il Dr. Pallavi Kshetrapal per l’aiuto con la logistica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni concesse a Suchitra Gopinath dal Dipartimento di Biotecnologie, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Materials

4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Amphotericin B Sigma Aldrich A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) HiMedia A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody Sigma Aldrich G8795
Anti-MyHC antibody (My32) Novus Biologicals NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A) Novus Biologicals NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) Novus Biologicals NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody DSHB DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 559869
Collagen Type 1 Merck C8919
D (+) Glucose Sigma Aldrich G7021
Dexamethasone SIGMA D4902
FACSCanto II or FACSAria III BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil GIBCO 10270106 not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 BD Biosciences 551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 BD Biosciences 557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 BD Biosciences 557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 BD Biosciences 555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 BD Biosciences 555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 BD Biosciences 560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 BD Biosciences 557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555786
FlowJo software BD Biosciences
Gentamicin Sigma Aldrich G1264
Horse serum HiMedia RM1239
Hydrocortisone Merck H4001
Laminin Merck L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides Hyclone SH30568.FS Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266 BD Biosciences 560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515 BD Biosciences 550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 BD Biosciences 555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 BD Biosciences 561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 HiMedia M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) HiMedia TCL049-100mL

References

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Cite This Article
Sevak, J. K., Gopinath, S. D. Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage. J. Vis. Exp. (186), e63725, doi:10.3791/63725 (2022).

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