Summary

Caracterización de la peritonitis séptica inducida por Salmonella Typhimurium en ratones

Published: July 29, 2022
doi:

Summary

Este protocolo describe la inducción de sepsis monobacteriana Gram-negativa en un sistema modelo de ratón. El modelo es útil para investigar las respuestas inflamatorias y letales del huésped durante la sepsis.

Abstract

La sepsis es una respuesta inmune desregulada del huésped a la invasión microbiana o daño tisular, que conduce a una lesión orgánica en un sitio distante del de la infección o daño. Actualmente, los modelos de sepsis de ratones ampliamente utilizados incluyen endotoxemia inducida por lipopolisacáridos (LPS), ligadura y punción cecal (CLP) y sistemas modelo de infección monobacteriana. Este protocolo describe un método para estudiar las respuestas del huésped durante la peritonitis séptica inducida por la infección por Salmonella Typhimurium en ratones. S. El typhimurium, un patógeno intracelular Gram-negativo, causa una enfermedad similar a la fiebre tifoidea en ratones.

Este protocolo elabora la preparación del cultivo, la inducción de la peritonitis séptica en ratones a través de la inyección intraperitoneal y los métodos para estudiar las respuestas sistémicas del huésped. Además, se presenta la evaluación de la carga bacteriana en diferentes órganos y el análisis citométrico de flujo del aumento del número de neutrófilos en el lavado peritoneal. Salmonella La sepsis inducida por typhimurium en ratones conduce a un aumento de las citoquinas proinflamatorias y a una rápida infiltración de neutrófilos en la cavidad peritoneal, lo que lleva a una menor supervivencia.

Cada paso en este protocolo ha sido optimizado, lo que resulta en una alta reproducibilidad de la patogénesis de la peritonitis séptica. Este modelo es útil para estudiar las respuestas inmunológicas durante la sepsis bacteriana, el papel de diferentes genes en la progresión de la enfermedad y los efectos de los fármacos para atenuar la sepsis.

Introduction

La sepsis se define como una respuesta inflamatoria e inmune sistémica desregulada a la invasión microbiana o daño tisular, que conduce a una lesión orgánica distante del sitio de infección o daño. El shock séptico es un subconjunto de sepsis caracterizado por hipotensión persistente durante la reanimación de volumen, con un riesgo sustancialmente mayor de mortalidad1. El público en general se ha vuelto más consciente de este trastorno durante la pandemia de COVID-19. A pesar de su alta mortalidad asociada, faltan datos epidemiológicos completos sobre la carga global de sepsis debido a la complejidad de su diagnóstico. En 2017, hubo 48,9 millones de incidencias de sepsis y 11 millones de muertes en todo el mundo, lo que representa el 19,7% de todas las muertes mundiales2. Además, un estudio sobre la prevalencia extendida de infección y sepsis relacionada en pacientes de unidades de cuidados intensivos encontró que el 62% de los aislamientos positivos de pacientes eran organismosgramnegativos 3.

Inicialmente, las investigaciones sobre la sepsis se centraron en delinear la patogénesis microbiana. Sin embargo, la comprensión de la “hipótesis del peligro”, que dicta cómo el huésped distingue a sí mismo y no-yo, llevó a la inclinación del equilibrio de la investigación de la sepsis hacia la comprensión de la respuesta del huésped a un patógeno invasor. Los modelos de sepsis en ratones ampliamente utilizados incluyen el modelo de endotoxemia inducida por lipopolisacáridos (LPS), los modelos de sepsis polimicrobiana, la ligadura cecal y la punción (CLP) y la peritonitis del stent ascendente del colon (CASP), y los modelos de infección monobacteriana4.

Hemos estandarizado un sistema modelo de ratón mediante la inducción de sepsis peritoneal utilizando Salmonella Typhimurium. Este modelo es ventajoso sobre otros porque Salmonella Typhimurium es un patógeno intracelular que imita la condición clínicamente relevante de la sepsis Gram-negativa. El resultado de la sepsis de peritonitis en este modelo es sistémico, con una mortalidad del 100% dentro de las 96 h posteriores a la infección. Por lo tanto, este modelo es fundamental en el estudio de las respuestas inflamatorias y letales del huésped. En este modelo, la sepsis es inducida por la inyección intraperitoneal de 0,5 millones de unidades formadoras de colonias (UFC) de Salmonella Typhimurium en un ratón C57BL/6 de 8-10 semanas de edad. La infección sistémica se puede confirmar mediante la evaluación de la carga bacteriana del órgano ~ 16 h después de la infección. Este artículo demuestra la sepsis de peritonitis inducida por Salmonella Typhimurium en ratones, caracteriza las alteraciones resultantes en la composición de células peritoneales y cuantifica la carga bacteriana en diferentes órganos.

Protocol

Todos los experimentos con Salmonella Typhimurium se llevaron a cabo en instalaciones de Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2). Se debe tener cuidado de usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado, garantizar la seguridad y seguir los métodos estándar de eliminación de riesgos biológicos BSL-2. Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo siguiendo las pautas establecidas por el Comité Institucional de Ética Animal, IISc. Los ratones fueron criados y mantenidos en el Centro Central de Animales…

Representative Results

Una caracterización detallada de la respuesta inmune del huésped utilizando este modelo particular se muestra en publicaciones anteriores 8,9. En esta sección se muestran algunos resultados representativos del protocolo descrito. Este modelo tiene como objetivo inducir la infección sistémica de S. Typhimurium por inyección intraperitoneal del cultivo bacteriano para inducir sepsis. Para confirmar la infección, los lisados del hígado y el bazo de …

Discussion

Este artículo describe un método para inducir una forma grave de sepsis bacteriana mediante la inyección intraperitoneal de Salmonella Typhimurium. Este modelo es ventajoso sobre otros, ya que Salmonella Typhimurium es un patógeno intracelular y, por lo tanto, altamente patógeno, imitando la condición clínicamente relevante de la sepsis Gram-negativa. El resultado de la sepsis de peritonitis en este modelo es sistémico, con una mortalidad del 100% dentro de las 96 h posteriores a la infección. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a la Instalación Central de Animales, IISc por suministrarnos ratones para la investigación. Este estudio fue financiado por subvenciones a DpN del Departamento de Biotecnología y la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería del Gobierno de la India. El apoyo de infraestructura del programa DBT-IISc y las subvenciones DST-FIST son muy reconocidos. Agradecemos a todos los miembros anteriores y actuales del laboratorio DpN por su apoyo.

Materials

Consumables
1 mL Sterile Syringe with 26 G needle Beckton Dickinson, Singapore 303060
1.5 mL Microcentrifuge Tube Tarsons, USA 500010
10 mL Sterile Syringe with 21 G needle Beckton Dickinson, Spain 307758
50 mL Conical Flask Tarsons, USA 441150
50 mL Graduated Centrifuge Tube Tarsons, USA 546041
50 mL Graduated Centrifuge Tube Tarsons, USA 546021
Cell spreader VWR, USA VWRU60828-680
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline HiMedia, Mumbai, India TS1006
Ethanol Merck 100983
FcR blocker BD Biosciences 553142
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106
FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 551460
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Hand based Homogenizer
Hemocytometer (Neubauer counting chamber) Rohem, India I.S. 10269
Luria Bertani Broth HiMedia, Mumbai, India M1245
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Petriplates Tarsons, USA 460091
RPMI Himedia, Mumbai, India AT060-10X1L
Salmonella-Shigella Agar HiMedia, Mumbai, India M108
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Equipments
Centrifuge Kubota
Flow cytometer BD FACSverse
Incubator N-biotek
Spectrophotometer Shimadzu
Weighing machine Sartorius

References

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Cite This Article
Chattopadhyay, A., Joseph, J. P., Shyam, S., Nandi, D. Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice. J. Vis. Exp. (185), e63695, doi:10.3791/63695 (2022).

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