Proteinlerin ve hidrasyon suyunun pikosaniye-nanosaniye dinamiklerini incelemek için yüksek çözünürlüklü nötron spektroskopisi

Nötron, temel fizikten biyolojiye kadar çeşitli alanlardaki örnekleri araştırmak için yıllar boyunca başarıyla kullanılan yüksüz ve büyük bir parçacıktır¹. Biyolojik uygulamalar için, küçük açılı nötron saçılması, elastik olmayan nötron saçılması ve nötron kristalografisi ve reflektometrisi yaygın olarak kullanılmaktadır ^2,3,4. Elastik olmayan nötron saçılması, kendi başına belirli bir etiketleme gerektirmeden dinamiklerin topluluk ortalamalı bir ölçümünü ve boyuta veya protein^5’e bağlı olmayan bir sinyal kalitesi sağlar. Ölçüm, incelenen protein için, deuterated bakteriyel lizat veya hatta in vivo ^3,6,7 gibi hücre içi ortamı taklit eden oldukça karmaşık bir ortam kullanılarak yapılabilir. Dinamikleri incelemek için farklı deney düzenekleri kullanılabilir, yani i) uçuş zamanı-alt-ps-ps dinamiklerine erişim sağlar, ii) ps-ns dinamiklerine geri saçılma-erişim sağlar ve iii) spin-echo-ns’den yüzlerce ns’ye kadar dinamiklere erişim sağlar. Nötron geri saçılması, Bragg’ın 2d sinθ = nλ yasasını kullanır; burada d, bir kristaldeki düzlemler arasındaki mesafe, θ saçılma açısı, n saçılma sırası ve λ dalga boyudur. Dedektörlere doğru geri saçılma için kristallerin kullanılması, tipik olarak ~ 0.8 μeV olan enerjide yüksek bir çözünürlük elde etmeyi sağlar. Enerji değişimini ölçmek için, gelen nötron dalga boyunu ^8,9,10 (Şekil 1) tanımlamak ve ayarlamak için geri saçılmada bir kristal taşıyan bir Doppler sürücüsü kullanılır veya enerji çözünürlüğü^11’deki bir düşüş pahasına bir uçuş zamanı kurulumu kullanılabilir.

Resim 1: Doppler tahrikli bir nötron geri saçılma spektrometresinin taslağı. Gelen ışın, numune konumundaki akıyı artıran faz uzayı dönüşümü (PST) kıyıcısı^42’ye çarpar. Daha sonra bir enerji_E1 (camgöbeği oku) seçen Doppler sürücüsü tarafından numuneye doğru geri saçılır. Nötronlar daha sonra numune tarafından dağılır (okların rengiyle temsil edilen farklı enerjilerle) ve Si 111 kristallerinden yapılmış analizörler, nötronları yalnızca belirli bir enerji E₀ (burada kırmızı renkli oklar) ile geri saçarlar. Bu nedenle, momentum transferi q , nötronun dedektör dizisi üzerinde tespit edilen konumundan elde edilir ve enerji transferi E₁– E₀ farkından elde edilir. PST tarafından üretilen nötron darbesi için beklenen uçuş süresi, doğrudan dedektör tüplerine doğru dağılmış nötronlardan gelen sinyali atmak için kullanılır. Kısaltma: PST = faz uzayı dönüşümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Geri saçılma spektroskopisi için, proteinler gibi hidrojen proton bakımından zengin numunelerden gelen sinyale ana katkı, S_inc (q, ω) saçılma yoğunluğunun Eq (1) ¹² ile gösterildiği tutarsız saçılmadan gelir

(1)

σ_inc, düşünülen elemanın tutarsız kesiti olduğunda, k’ dağınık dalga vektörünün normu, k gelen dalga vektörünün normu, q (= k – k’) momentum transferi, r_j (t) atomunun t zamanındaki konum vektörü ve ω gelen nötron ile sistem arasındaki enerji transferine karşılık gelen frekanstır. Açısal parantezler topluluk ortalamasını gösterir. Bu nedenle, tutarsız saçılma, atom konumlarının zamanla topluluk ortalamalı tek parçacık kendi kendine korelasyonunu araştırır ve sistemdeki tüm atomlar ve farklı zaman kökenleri (topluluk ortalaması) üzerinde ortalamalı öz-dinamikleri verir. Saçılma fonksiyonu, Eq (2) tarafından gösterilen van Hove korelasyon fonksiyonunun uzaydaki Fourier dönüşümü olarak görülebilen ara saçılma fonksiyonu I(q, t)’nin zamanındaki Fourier dönüşümüdür:

(2)

Burada ρ(r,t), r pozisyonunda ve t ¹³ zamanında bir atom bulmanın olasılık yoğunluğudur.

Bir Fickian difüzyon işlemi için, kendiliğinden difüzyon fonksiyonu, γ = Dq² tarafından verilen çizgi genişliğindeki bir Lorentzian’dan oluşan bir saçılma fonksiyonunda çift Fourier dönüşümünden sonra sonuçlanır (bakınız Eq (3)).

(3)

Singwi ve Sjölander’in ps-ns iç protein dinamiği¹⁴ için atlama difüzyon modeli veya Sears’ın hidrasyon suyu^15,16,17 için dönme modeli gibi daha sofistike modeller geliştirildi ve yararlı bulundu.

ILL, Grenoble, Fransa’daki nötron geri saçılma (NBS) cihazı IN16B ^8,9’da (Ek Şekil S1), proteinlerle yaygın olarak kullanılan bir kurulum, gelen dalga boyunu ayarlamak için Doppler tahrikli analizörler için Si 111 kristallerinden oluşur (Ek Şekil S2A), böylece momentum transfer aralığına erişim sağlar ~0.2 Å-1 < q < ~2 ^Å-1 ve -30 μeV enerji transfer aralığı < < 30 μeV-birkaç ps ile birkaç ns arasında değişen zaman ölçeklerine ve birkaç şmesafeye karşılık gelir. Ek olarak, IN16B, sabit bir enerji aktarımında veri toplamayı içeren elastik ve elastik olmayan sabit pencere taramaları (E/IFWS)¹⁰ gerçekleştirme imkanı sunar. Nötronlarla çalışırken akı sınırlı olduğundan, E / IFWS, bir enerji transferi için akının maksimize edilmesine izin verir, böylece tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için gereken edinme süresini azaltır. Daha yeni bir seçenek, Doppler tahrikinden daha yüksek bir akı ile, ancak daha düşük bir enerji çözünürlüğü pahasına (Ek Şekil S2B) çok çeşitli enerji transferlerinin (örneğin, -150 μeV < < 150 μeV) ölçülmesine izin veren geri saçılma ve uçuş süresi spektrometresi (BATS) mod^11’dir.

Nötron saçılmasının önemli bir özelliği, tutarsız kesit σ_inc’in hidrojen için döteryumdan 40 kat daha yüksek bir değere sahip olması ve biyolojik örneklerde yaygın olarak bulunan diğer elementler için ihmal edilebilir olmasıdır. Bu nedenle, sıvı bir ortamdaki proteinlerin dinamikleri, deuterated bir tampon kullanılarak incelenebilir ve toz durumu, D₂O ile hidratlanmış hidrojene protein tozu ile protein iç dinamiklerinin incelenmesine veya_H2O ile hidratlanmış perdeuterated protein tozu için hidrasyon suyunun incelenmesine izin verir. Sıvı halde, nötron geri saçılması tipik olarak proteinlerin kütle merkezi kendi kendine difüzyonuna (Fickian tipi difüzyon) ve iç dinamiklerine aynı anda erişilmesini sağlar. İkincisi, genellikle atlama difüzyon modeli veya diğerleri ^3,18 tarafından tanımlanan omurga ve yan zincir hareketleridir. Hidrojene protein tozlarında, protein difüzyonu yoktur ve sadece iç dinamiklerin modellenmesi gerekir. Hidrasyon suyu için, su moleküllerinin translasyonel ve rotasyonel hareketlerinin katkıları, veri analizi sürecinde ayrım yapmalarını sağlayan momentum transferi q’ya farklı bir bağımlılık sunar¹⁷.

Bu makale, nötron geri saçılma yöntemini, açılabildiği, çapraz β paterni^19,20 olarak adlandırılan β iplikçik yığınlarından oluşan kanonik bir formda toplanabildiği ve uzun lifler oluşturduğu tespit edilen proteinlerin incelenmesiyle göstermektedir. Bu, Alzheimer veya Parkinson hastalıkları gibi nörodejeneratif bozukluklardaki merkezi rolü nedeniyle kapsamlı bir şekilde çalışılan amiloid agregasyonudur^21,22. Amiloid proteinlerinin incelenmesi, ^23,24 oynayabilecekleri fonksiyonel rol veya yeni biyomateryallerin geliştirilmesi için yüksek potansiyelleri ile de motive edilmektedir²⁵. Amiloid agregasyonunun fizikokimyasal belirleyicileri belirsizliğini korumaktadır ve son yıllarda muazzam ilerlemelere rağmen amiloid agregasyonunun genel bir teorisi mevcut değildir^21,26.

Amiloid agregasyonu, protein yapısında ve stabilitesinde zamanla değişiklikler anlamına gelir; bunun çalışması, doğal olarak, protein konformasyon stabilitesi, protein fonksiyonu ve protein enerjisi manzarası ile bağlantılı dinamikleri ima eder²⁷. Dinamik, en hızlı hareketler²⁸ için entropik katkı yoluyla belirli bir durumun kararlılığı ile doğrudan bağlantılıdır ve protein fonksiyonu, ışığa duyarlı proteinler²⁹ için sub-ps’den alan hareketleri için ms’ye kadar çeşitli zaman ölçeklerinde hareketlerle sürdürülebilir, bu da pikosaniye-nanosaniye dinamikleri³⁰ ile kolaylaştırılabilir.

Amiloid proteinlerini incelemek için nötron geri saçılma spektroskopisini kullanmanın iki örneği, biri protein dinamiklerini incelemek için sıvı halde ve diğeri hidrasyon su dinamiklerini incelemek için hidratlanmış toz halinde. İlk örnek, lizozimin μm boyutlu kürelere (partiküller olarak adlandırılır) gerçek zamanlı olarak toplanması ile ilgilidir 5 ve^{ikincisi, insan} proteini tau^31’in doğal ve toplanmış durumlarında su dinamiklerinin karşılaştırılmasıdır.

Lizozim, bağışıklık savunmasında rol oynayan bir enzimdir ve 129 amino asit kalıntısından oluşur. Lizozim, deuterated tamponda 10.5 pD’de ve 90 ° C’lik bir sıcaklıkta partiküller oluşturabilir. Nötron saçılması ile, lizozimin kütle merkezi difüzyon katsayısının zaman evriminin, tiyoflavin T floresansının tek üstel kinetiğinin (amiloid çapraz β paternlerinin oluşumunu izlemek için kullanılan bir floresan probu³²) izlediğini gösterdik, bu da oluşum partikül üst yapılarının ve çapraz β desenlerinin aynı oranda tek bir adımda gerçekleştiğini gösterir. Dahası, iç dinamikler toplama süreci boyunca sabit kalmıştır, bu da NBS enstrümanlarında gözlemlenemeyen hızlı bir konformasyonel değişim veya agregasyon sırasında protein iç enerjisinde önemli bir değişikliğin olmaması ile açıklanabilir.

İnsan proteini tau, Alzheimer hastalığı^33’te özellikle rol oynayan 2N4R izoformu için 441 amino asitten oluşan içsel olarak düzensiz bir proteindir (IDP). Perdeuterated protein tau tozları üzerinde nötron geri saçılması kullanarak, hidrasyon suyu dinamiklerinin lif durumunda arttığını, translasyonel hareketlere maruz kalan daha yüksek bir su molekülü popülasyonu olduğunu gösterdik. Sonuç, hidrasyon suyu entropisindeki bir artışın tau’nun amiloid fibrilasyonunu tetikleyebileceğini düşündürmektedir.