Espectroscopia de Nêutrons de Alta Resolução para Estudo da Dinâmica de Proteínas e Água de Hidratação de Picossegundos-Nanossegundos

O nêutron é uma partícula massiva e sem carga que tem sido usada com sucesso ao longo dos anos para sondar amostras em vários campos, da física fundamental à biologia¹. Para aplicações biológicas, o espalhamento de nêutrons a baixo ângulo, o espalhamento inelástico de nêutrons, a cristalografia e a reflectometria de nêutrons^são extensivamente utilizados ^2,3,4. O espalhamento inelástico de nêutrons fornece uma medida média da dinâmica sem a necessidade de marcação específica per se, e uma qualidade de sinal que não depende do tamanho ou da proteína⁵. A medida pode ser feita utilizando um ambiente de alta complexidade para a proteína em estudo que mimetiza o meio intracelular, como um lisado bacteriano deuterado ou mesmo in^vivo3,6,7. Diferentes configurações experimentais podem ser usadas para estudar a dinâmica, a saber: i) tempo de voo dando acesso à dinâmica sub-ps-ps, ii) retroespalhamento-dando acesso à dinâmica ps-ns, e iii) spin-eco-dando acesso à dinâmica de ns a centenas de ns. O retroespalhamento de nêutrons faz uso da lei de Bragg 2d sinθ = nλ, onde d é a distância entre planos em um cristal, θ o ângulo de espalhamento, n a ordem de espalhamento e λ o comprimento de onda. O uso de cristais para retroespalhamento em direção aos detectores permite alcançar uma alta resolução de energia, tipicamente ~0,8 μeV. Para medir a troca de energia, um drive Doppler carregando um cristal em retroespalhamento é usado para definir e sintonizar o comprimento de onda de nêutrons de entrada ^8,9,10 (Figura 1), ou uma configuração de tempo de voo pode ser usada ao custo de uma diminuição na resolução de energia ¹¹.

Figura 1: Esboço de um espectrômetro de retroespalhamento de nêutrons com acionamento Doppler. O feixe de entrada atinge o chopper⁴² de transformação do espaço de fase (PST), o que aumenta o fluxo na posição da amostra. Em seguida, ele é retroespalhado em direção à amostra pelo drive Doppler, que seleciona uma energia E₁ (seta ciano). Os nêutrons são então espalhados pela amostra (com diferentes energias representadas pela cor das setas) e os analisadores, feitos de cristais de Si 111, só retroespalharão nêutrons com uma energia específica E₀ (setas de cor vermelha aqui). Assim, a transferência de momento q é obtida a partir da posição detectada do nêutron no arranjo do detector, e a transferência de energia é obtida a partir da diferença E₁– E₀. O tempo de voo esperado para o pulso de nêutrons produzido pelo PST é usado para descartar o sinal dos nêutrons espalhados diretamente em direção aos tubos do detector. Abreviação: PST = transformação do espaço de fase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para a espectroscopia de retroespalhamento, a principal contribuição para o sinal de amostras ricas em prótons de hidrogênio, como proteínas, vem do espalhamento incoerente, para o qual a intensidade de espalhamento S_inc(q, ω) é mostrada por Eq (1)¹²

(1º)

Onde σ_inc é a seção transversal incoerente do elemento considerado, k’ é a norma do vetor de onda disperso, k a norma do vetor de onda de entrada, q (= k – k’) a transferência de momento, r j(t) o vetor de posição do átomo _j no tempo t, e ω a frequência correspondente à transferência de energia entre o nêutron de entrada e o sistema. Os colchetes angulares denotam a média do conjunto. Assim, o espalhamento incoerente sonda a autocorrelação de partícula única média do conjunto das posições dos átomos com o tempo e fornece a autodinâmica média sobre todos os átomos no sistema e diferentes origens de tempo (média do conjunto). A função de espalhamento é a transformada de Fourier no tempo da função de espalhamento intermediário I(q, t), que pode ser vista como a transformada de Fourier no espaço da função de correlação de van Hove mostrada por Eq (2):

(2º)

Onde ρ(r,t) é a densidade de probabilidade de encontrar um átomo na posição r e no tempo t ¹³.

Para um processo de difusão fickiano, a função de autodifusão resulta (ver Eq (3)) após uma transformada dupla de Fourier em uma função de espalhamento consistindo em um Lorentziano de largura de linha dado por γ = Dq².

(3º)

Modelos mais sofisticados foram desenvolvidos e considerados úteis, como o modelo de difusão por salto de Singwi e Sjölander para dinâmica interna de proteínas ps-ns¹⁴ ou o modelo de rotação por Sears para água de hidratação^15,16,17.

No instrumento de retroespalhamento de nêutrons (NBS) IN16B ^8,9 no ILL, Grenoble, França (Figura Suplementar S1), uma configuração comumente usada com proteínas consiste em cristais de Si 111 para os analisadores com um drive Doppler para sintonizar o comprimento de onda de entrada (Figura Suplementar S2A), dando acesso à faixa de transferência de momento ~^0,2 Å-1 < q < ~2 ^Å-1 e faixa de transferência de energia de ^–30 μeV < < 30 μeV-correspondente a escalas de tempo que variam de alguns ps a alguns ns e distâncias de alguns Å. Além disso, o IN16B oferece a possibilidade de realizar varreduras de janela fixa elástica e inelástica (E/IFWS)¹⁰, que incluem a aquisição de dados em uma transferência de energia fixa. Como o fluxo é limitado quando se trabalha com nêutrons, o E/IFWS permite maximizar o fluxo para uma transferência de energia, reduzindo assim o tempo de aquisição necessário para obter uma relação sinal-ruído satisfatória. Uma opção mais recente é o modo¹¹ do espectrômetro de retroespalhamento e tempo de voo (BATS), que permite a medição de uma ampla faixa de transferências de energia (por exemplo, -150 μeV < < 150 μeV), com um fluxo maior do que com o acionamento Doppler, mas ao custo de uma resolução de energia menor (Figura Suplementar S2B).

Uma propriedade importante do espalhamento de nêutrons é que a seção transversal incoerente σ_inc tem um valor 40 vezes maior para o hidrogênio do que para o deutério e é insignificante para outros elementos comumente encontrados em amostras biológicas. Portanto, a dinâmica de proteínas em ambiente líquido pode ser estudada usando um tampão deuterado, e o estado de pó permite o estudo da dinâmica interna de proteínas com proteína hidrogenada em pó hidratadacom D 2 O, ou o estudo de água de hidratação para proteína perdeuterada em pó hidratada com H₂O. No estado líquido, o retroespalhamento de nêutrons normalmente permite o acesso simultâneo do centro de massa de autodifusão de proteínas (difusão tipo fickiano) e sua dinâmica interna. Estes últimos são movimentos da espinha dorsal e da cadeia lateral usualmente descritos pelo chamado modelo de salto-difusão^{ou outros3,18}. Em pós de proteína hidrogenada, a difusão da proteína está ausente e apenas a dinâmica interna precisa ser modelada. Para a água de hidratação, as contribuições dos movimentos de translação e rotação das moléculas de água apresentam uma dependência diferente da transferência de momento q, o que permite sua distinção no processo de análise dos dados¹⁷.

Este trabalho ilustra o método de retroespalhamento de nêutrons com o estudo de proteínas que se mostraram capazes de se desdobrar, agregar em uma forma canônica composta por pilhas de fitas de β – o chamado padrão de β cruzada^19,20 – e formar fibras alongadas. Trata-se da chamada agregação amiloide, que é extensivamente estudada devido ao seu papel central em doenças neurodegenerativas, como as doenças de Alzheimer ou^{Parkinson21,22}. O estudo das proteínas amiloides também é motivado pelo papel funcional que elas podem desempenhar23,24 ou seu alto potencial para o desenvolvimento de novos^{biomateriais25}. Os determinantes físico-químicos da agregação amiloide permanecem obscuros, e nenhuma teoria geral da agregação amiloide está disponível, apesar do enorme progresso nos últimos^anos21,26.

A agregação amiloide implica mudanças na estrutura e estabilidade de proteínas com o tempo, cujo estudo implica naturalmente dinâmica, ligada à estabilidade da conformação proteica, função proteica e paisagem energética proteica²⁷. A dinâmica está diretamente ligada à estabilidade de um estado específico através da contribuição entrópica para os movimentos mais rápidos²⁸, e a função da proteína pode ser sustentada por movimentos em várias escalas de tempo, desde sub-ps para proteínas sensíveis à luz²⁹ até ms para movimentos de domínio, o que pode ser facilitado pela dinâmica picossegundo-nanossegundo³⁰.

Dois exemplos de uso de espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons para estudar proteínas amiloides serão apresentados, um no estado líquido para estudar a dinâmica de proteínas e outro no estado pó hidratado para estudar a dinâmica da água de hidratação. O primeiro exemplo diz respeito à agregação de lisozima em esferas de tamanho μm (chamadas partículas) seguidas em tempo real⁵, e o segundo uma comparação da dinâmica da água em estados nativos e agregados da proteína humana tau³¹.

A lisozima é uma enzima envolvida na defesa imunológica e é composta por 129 resíduos de aminoácidos. A lisozima pode formar partículas em tampão deuterado a pD de 10,5 e a uma temperatura de 90 °C. Com o espalhamento de nêutrons, mostramos que a evolução temporal do coeficiente de difusão do centro de massa da lisozima segue a cinética exponencial única da fluorescência da tioflavina T (uma sonda fluorescente usada para monitorar a formação de padrões de β cruzada amiloide³²), indicando que a formação de superestruturas particuladas e padrões de β cruzada ocorrem em uma única etapa com a mesma taxa. Além disso, a dinâmica interna permaneceu constante durante todo o processo de agregação, o que pode ser explicado por uma rápida mudança conformacional que não pode ser observada nos instrumentos NBS, ou pela ausência de mudança significativa na energia interna da proteína na agregação.

A proteína humana tau é uma proteína intrinsecamente desordenada (IDP) constituída por 441 aminoácidos para a chamada isoforma 2N4R, que está notavelmente envolvida na doença de Alzheimer³³. Usando retroespalhamento de nêutrons em pós de proteína perdeuterada tau, mostramos que a dinâmica da água de hidratação está aumentada no estado de fibra, com uma maior população de moléculas de água sofrendo movimentos de translação. O resultado sugere que um aumento na entropia da água de hidratação pode conduzir a fibrilação amiloide da tau.