Summary

Spatiotemporale subcellulaire manipulatie van het microtubulecytoskelet in het levende pre-implantatiemuismyo met behulp van photostatinen

Published: November 30, 2021
doi:

Summary

Typische microtubuleremmers, die veel worden gebruikt in fundamenteel en toegepast onderzoek, hebben verstrekkende effecten op cellen. Onlangs ontstonden fototatinen als een klasse van fotoschakelbare microtubuleremmers, in staat tot onmiddellijke, omkeerbare, spatiotemporaal nauwkeurige manipulatie van microtubuli. Dit stapsgewijze protocol beschrijft de toepassing van fototatinen in een 3D live pre-implantatiemuismyo.

Abstract

Het microtubule cytoskelet vormt het raamwerk van een cel en is fundamenteel voor intracellulair transport, celdeling en signaaltransductie. Traditionele farmacologische verstoring van het alomtegenwoordige microtubulinetwerk met behulp van bijvoorbeeld nocodazol kan verwoestende gevolgen hebben voor elke cel. Reversibel fotoschakelbare microtubuleremmers hebben het potentieel om de beperkingen te overwinnen door medicijneffecten op een spatiotemporaal gecontroleerde manier te implementeren. Een dergelijke familie van geneesmiddelen is de op azobenzeen gebaseerde fototatinen (PST’s). Deze verbindingen zijn inactief in donkere omstandigheden en bij verlichting met UV-licht binden ze zich aan de colchicine-bindingsplaats van β tubuline en blokkeren ze microtubule polymerisatie en dynamische omzet. Hier is de toepassing van PST’s in het 3-dimensionale (3D) levende pre-implantatiemuismyo bedoeld om het microtubulinetwerk op subcellulair niveau te verstoren. Dit protocol biedt instructies voor de experimentele opstelling, evenals lichtactiverings- en deactiveringsparameters voor PST’s met behulp van live-cell confocale microscopie. Dit zorgt voor reproduceerbaarheid en stelt anderen in staat om deze procedure toe te passen op hun onderzoeksvragen. Innovatieve fotoschakelaars zoals PST’s kunnen evolueren als krachtige hulpmiddelen om het begrip van het dynamische intracellulaire microtubulinetwerk te vergroten en het cytoskelet in realtime niet-invasief te manipuleren. Bovendien kunnen PST’s nuttig zijn in andere 3D-structuren zoals organoïden, blastoïden of embryo’s van andere soorten.

Introduction

De microtubule-architectuur varieert sterk tussen verschillende celtypen om verschillende functies te ondersteunen 1,2. De dynamische aard van groei en krimp maakt een snelle aanpassing aan extra- en intracellulaire signalen mogelijk en om te reageren op de steeds veranderende behoeften van een cel. Daarom kan het worden beschouwd als de “morfologische vingerafdruk” die een sleutelrol speelt in de cellulaire identiteit.

Farmacologische targeting van het microtubule cytoskelet met behulp van kleine molecuulremmers heeft geleid tot een overvloed aan fundamentele ontdekkingen in ontwikkelingsbiologie, stamcelbiologie, kankerbiologie en neurobiologie 3,4,5,6,7. Deze aanpak, hoewel onmisbaar, brengt verschillende beperkingen met zich mee, zoals toxiciteit en off-target effecten. Een van de meest gebruikte microtubule-targeting middelen, nocodazol, is bijvoorbeeld een krachtig microtubule-depolymeriserend medicijn8. Kleine-molecuulremmers zoals nocodazol zijn echter actief vanaf het moment van toepassing en, gezien de essentiële aard van het microtubule cytoskelet voor veel kritieke cellulaire functies, kan wereldwijde depolymerisatie van microtubuli off-target effecten veroorzaken, die mogelijk ongeschikt zijn voor veel toepassingen. Bovendien is de behandeling met nocodazol onomkeerbaar, tenzij monsters vrij van het geneesmiddel worden gewassen, waardoor continue live beeldvorming en dus nauwkeurige tracking van individuele microtubulifilamenten wordt voorkomen.

De ontwikkeling van lichtgeactiveerde verbindingen begon met de creatie van foto-onopgeloste moleculen en heeft een nieuw tijdperk ingeluid in het richten en monitoren van de effecten van microtubuligroeiremming op een nauwkeurige en spatiotemporaal gecontroleerde manier. Een familie van reversibel fotoschakelbare geneesmiddelen, fototatinen (PST’s), werden ontwikkeld door de stilbeencomponent van combretastatine A-4 te vervangen door azobenzeen9. PST’s zijn inactief tot verlichting met UV-licht, waarbij de inactieve transconfiguratie wordt omgezet in de actieve cis-configuratie door omkeerbare isomerisatie. Cis-PST’s remmen de polymerisatie van microtubuli door zich te binden aan de colchicine-bindingsplaats van β-tubuline, waardoor de interface met β-tubuline wordt geblokkeerd en dimerisatie wordt voorkomen die nodig is voor de groei van microtubuli10. Onder een cohort van PST’s is PST-1P naar voren gekomen als een loodverbinding omdat het de hoogste potentie heeft, volledig in water oplosbaar is en een snel begin van bioactiviteit vertoont na verlichting.

De meest effectieve trans– naar cis-isomerisatie van PST’s vindt plaats op golflengten tussen 360-420 nm, wat dubbele opties voor PST-activering mogelijk maakt. Een 405 nm laserlijn op een typische confocale microscoop kan worden toegediend voor een optimale ruimtelijke targeting van microtubuligroeiremming. De mogelijkheid om de locatie en timing van PST-activering te lokaliseren door middel van 405 nm laserverlichting vergemakkelijkt nauwkeurige temporele en ruimtelijke controle, waardoor verstoring van de microtubuledynamica op subcellulair niveau mogelijk is, binnen subseconde respons maal9. Als alternatief zorgt een betaalbaar LED UV-licht ervoor dat de verlichting van het hele organisme de microtubule-architectuur in het hele organisme verstoort. Dit kan een kosteneffectief alternatief zijn voor onderzoekers voor wie het nauwkeurig getimede begin van remming, in plaats van ruimtelijke targeting, het doel is. Een ander kenmerk van PST’s is hun on-demand inactivatie door groen licht toe te passen van een golflengte in het bereik van 510-540 nm9. Dit maakt het traceren van microtubule filamenten voor, tijdens en na PST-gemedieerde groeiremming mogelijk.

PST’s, hoewel nog steeds een relatief recent ontwerp, zijn gebruikt in tal van in vitro toepassingen op verschillende onderzoeksgebieden11, waaronder onderzoek naar nieuwe mechanismen van celmigratie in amoeboïden12, in neuronen geïsoleerd uit de hersenen van de pasgeboren muis13, en vleugelepitheelontwikkeling in Drosophila melanogaster14 . Andere lichtreactieve geneesmiddelen hebben bewezen waardevolle hulpmiddelen te zijn bij gerichte verstoring van de cellulaire functie. Een analoog van blebbistatine, azidoblebbistatine, werd bijvoorbeeld gebruikt voor verbeterde myosineremming onder verlichting15,16. Dit benadrukt het potentieel voor nieuwe ontdekkingen als gevolg van het vermogen tot spatiotemporaal gecontroleerde remming van de cellulaire functie.

Levende 3D-organismen presenteren prachtige maar delicatere systemen om microtubulidynamica te manipuleren op een heel dier,eencellig of subcellulair niveau onder fysiologische omstandigheden. Met name het pre-implantatie muizenembryo biedt uitzonderlijk inzicht in de innerlijke werking van de cel en intercellulaire relaties binnen een organisme17. Temporeel en ruimtelijk gerichte opeenvolgende cycli van activering en deactivering van PST’s droegen bij aan de karakterisering van de interfasebrug, een post-cytokinetische structuur tussen cellen, als een niet-centrosomaal microtubuliorganiserend centrum in het pre-implantatiemuismyo16. Een vergelijkbare experimentele opstelling toonde de betrokkenheid van groeiende microtubuli bij de afdichting van het muizenembryo om blastocystvorming18 mogelijk te maken. Bovendien werden PST’s ook gebruikt in hele zebravisembryo’s om neuronale celmigratie te onderzoeken door de groei van microtubuli in een subset van cellen in de achterhersenente remmen 19.

Dit protocol beschrijft de experimentele opstelling en het gebruik van PST-1P in het pre-implantatiemuismyo. De instructies die hier worden gepresenteerd, kunnen ook de toepassing van PST’s begeleiden voor een breed scala aan doelstellingen, zoals het bestuderen van chromosoomsegregatie en celdeling, handel in intracellulaire lading en celmorfogenese en migratie. Bovendien zullen dergelijke studies de implementatie van PST’s in organoïde systemen, blastoïden en andere embryomodellen zoals Caenorhabditis elegans en Xenopus laevis helpen, evenals mogelijk het gebruik van PST’s voor in-vitrofertilisatietechnologieën uitbreiden.

Protocol

Experimenten werden goedgekeurd door de Monash Animal Ethics Committee onder dierethiek nummer 19143. Dieren werden gehuisvest in specifieke pathogeenvrije dierhuisomstandigheden in de dierenfaciliteit (Monash Animal Research Platform) in strikte overeenstemming met ethische richtlijnen. 1. Pre-implantatie muizenembryoverzameling Superovuleren en paren muizen zoals eerder beschreven 16,18, in overeenstemming …

Representative Results

In overeenstemming met het protocol werden pre-implantatiemuismyo’s micro-geïnjecteerd met cRNA voor EB3, gelabeld met rood fluorescerend dTomato (EB3-dTomato). Dit maakt de visualisatie van groeiende microtubuli mogelijk terwijl EB3 zich bindt aan polymeriserende microtubuli plus uiteinden24. De experimenten werden 3 dagen na de bevruchting (E3) uitgevoerd wanneer het muizenembryo uit 16 cellen bestaat. Elke andere pre-implantatie ontwikkelingsstadium kan worden gebru…

Discussion

Het microtubulinetwerk is een integraal onderdeel van de fundamentele innerlijke werking van een cel. Bijgevolg biedt dit uitdagingen bij het manipuleren van microtubulidynamica in levende organismen, omdat elke verstoring van het netwerk de neiging heeft wijdverspreide gevolgen te hebben voor alle aspecten van de cellulaire functie. De opkomst van fotoschakelbare microtubule-targeting verbindingen biedt een manier om het cytoskelet nauwkeurig te manipuleren op een subcellulair niveau, met superieure controle voor de ind…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Dr. Oliver Thorn-Seshold en Li Gao bedanken voor het verstrekken van fototatines en advies over manuscriptvoorbereiding, Monash Production voor filmondersteuning en Monash Micro Imaging voor microscopie-ondersteuning.

Dit werk werd ondersteund door de National Health and Medical Research Council (NHMRC) projectsubsidie APP2002507 aan J.Z. en de Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR) Azrieli Scholarship aan J.Z. Het Australian Regenerative Medicine Institute wordt ondersteund door subsidies van de staatsregering van Victoria en de Australische regering.

Materials

Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177 For mouth aspiration apparatus
Chamber slides – LabTek Thermo Fisher Scientific NUN155411
cRNA encoding for EB3-dTomato N/A N/A Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit
Culture dishes – 35mm Thermo Fisher Scientific 150560
Human chorionic growth hormone Sigma-Aldrich C8554
Human Tubal Fluid (HTF) medium Cosmo-Bio CSR-R-B071
Imaris Image Analysis Software Bitplane
Immersion Oil W 2010 Carl Zeiss 444969-0000-000 For use with microscope immersion objective
LED torch – Red light Celestron 93588
M2 medium Sigma-Aldrich M7167
Mice – wild-type FVB/N, males and females N/A N/A Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.
Microcapillary Pipettes – Kimble Sigma-Aldrich Z543306 For mouth aspiration apparatus
Microinjection buffer N/A N/A 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
Mineral oil Origio ART-4008-5P
mMessage In vitro Transcription kit Thermo Fisher Scientific AM1340
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium Cosmo-Bio CSR-R-B074
Pregnant mare serum gonadotrophin Prospec Bio HOR-272
PST-1P N/A N/A Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA purification kit Sangon B511361-0100
Ultrapure water Sigma-Aldrich W1503
ZEN Black Software Carl Zeiss

References

  1. Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
  2. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
  3. Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
  4. Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
  5. Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
  6. Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
  7. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  8. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  9. Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
  10. Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
  11. Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
  12. Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154 (2020).
  13. Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404 (2018).
  14. Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
  15. Kepiro, M., et al. Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).
  16. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  17. White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
  18. Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
  19. Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).
  20. Rulicke, T. Pronuclear microinjection of mouse zygotes. Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).
  21. Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).
  22. Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).
  23. Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).
  24. Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992 (2020).
  25. Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
  26. Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
  27. van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. Optogenetic control of microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).
  28. Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
  29. Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
  30. Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
  31. Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
  32. Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).
  33. Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).

Play Video

Cite This Article
Greaney, J., Hawdon, A., Stathatos, G. G., Aberkane, A., Zenker, J. Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins. J. Vis. Exp. (177), e63290, doi:10.3791/63290 (2021).

View Video