体外 使用表达β半乳糖苷酶的寄生虫针对 克氏锥虫 的所有生命周期阶段进行药物筛选

恰加斯病（ChD）或美洲锥虫病是由鞭毛原生动物 克氏锥虫 （克氏锥虫）引起的寄生虫病。ChD始于无症状或无症状的急性期，通常未被诊断，然后是终身慢性期。在慢性病中，约 30% 的患者在感染后数十年表现出各种使人衰弱的疾病，包括心肌病、巨消化系统综合征或两者兼有，死亡率范围为 0.2% 至 20%^1，2，3。无症状的慢性患者可能没有临床体征，但终生血清学阳性。

据估计，全世界约有700万人受到感染，其中大部分来自ChD流行的拉丁美洲。在这些国家， 克氏锥虫 主要通过受感染的吸血锥蝽臭虫（媒介传播）传播，较少通过摄入含有寄生虫的锥蝽臭螈粪便污染的食物进行口头传播².此外，寄生虫可以通过胎盘从伤寒病母亲传播给新生儿，通过输血或在器官移植期间传播。这些独立于媒介的感染和人类迁徙方式助长了该病的全球传播，北美、欧洲以及一些非洲、东地中海和西太平洋国家的病例数量不断增加就证明了这一^{点 4}.ChD被认为是一种被忽视的疾病，因为病媒传播与贫困密切相关，是一个主要的公共卫生问题，特别是在拉丁美洲低收入国家。虽然有可用的治疗方法，但在拉丁美洲，ChD的死亡率是包括疟疾在内的寄生虫病中最高的²。

在1960年代末和1970年代初引入了两种用于ChD治疗的注册药物：硝呋替莫和苯硝唑⁵。这两种药物在成人、儿童和先天性感染新生儿以及慢性感染儿童的急性期均有效，通常可治愈这些药物。然而，只有少数人被诊断得足够早，可以及时接受治疗。根据最新的临床试验，这两种药物在成人中都有重要的局限性，并且在减轻慢性病患者的症状方面无效;因此，它们在这个阶段的使用是有争议的。其他缺点是需要延长治疗期（60-90天）和观察到频繁，严重的不良反应，这导致^{感染者比例}6^，7停止治疗。据估计，只有不到10%的ChD患者被诊断出来，甚至更少的人能够获得治疗，因为许多受影响的人生活在农村地区，无法获得或几乎没有获得医疗保健^的机会8。这些事实凸显了迫切需要寻找针对T. cruzi的新药，以实现更有效，安全和适用于现场治疗，特别是对于慢性期。在这方面，开发更有效化合物的另一个挑战是评估体外和体内药物疗效^{的系统的限制}9。

尽管用于鉴定潜在药物靶点的化学生物学和基因组方法已被用于运动弓形寄生虫，但与布鲁氏锥虫或利什曼原虫相比，克氏锥虫中可用的基因组工具有限。因此，筛选具有杀锥虫活性的化合物仍然是寻找针对ChD的新化疗候选药物最常用的方法，通常，在克氏锥虫中发现的药物必须从在体外测定中测试新药对上胚芽阶段的作用开始。几十年来，测量候选化合物对克氏锥虫的抑制作用的唯一方法是手动显微镜计数，这是费力，耗时且依赖于操作员的。此外，这种方法适用于测定少量化合物，但对于大型化合物库的高通量筛选是不可接受的。如今，许多研究都是从分析来自不同来源的大量化合物开始的，这些化合物在体外进行测定，测试它们抑制寄生虫生长的能力。已经开发了比色法和荧光法来提高这些测定的通量，提高筛选的客观性并使整个过程不那么繁琐⁹。

最广泛使用的比色法之一是基于由Bucknet和合作者¹⁰首次描述的转染寄生虫的β半乳糖苷酶活性。由重组寄生虫表达的β-半乳糖苷酶将显色底物氯酚红β-D-半乳糖吡喃糖苷（CPRG）水解为氯酚红，这可以使用微孔板分光光度计轻松测量比色。因此，在多种化合物存在下寄生虫的生长可以在微量滴定板中同时进行评估和定量。该方法已应用于测试上胚层形式（存在于昆虫载体中），锥虫鞭毛虫和细胞内隵突（寄生虫的哺乳动物阶段）的药物。此外，几种用pBS：CL-Neo-01/BC-X-10质粒（pLacZ）¹⁰转染以表达大肠杆菌β半乳糖苷酶的重组克氏锥虫菌株已经可用（并且可以构建新的），这允许评估来自不同离散分型单元（DTU）的寄生虫，这些寄生虫可能对相同的化合物表现不一致^{10，11，12，13}.该方法已成功用于评估化合物在低通量和高通量筛选^12，13中的对克氏锥虫^的活性。类似的方法也用于其他原生动物寄生虫，包括弓形虫和墨西哥利什曼原虫^14，15。

本文描述并展示了一种使用表达β半乳糖苷酶的寄生虫对克氏锥虫所有生命周期阶段进行体外药物筛选的详细方法。这里介绍的测定是用表达β半乳糖苷酶的克氏锥虫谱系进行的，该谱系是通过用pLacZ质粒（Dm28c / pLacZ）转染来自DTU I¹³的克氏锥虫Dm28c菌株而获得的。此外，相同的方案可以很容易地适用于其他菌株，以比较化合物之间以及克氏锥虫菌株或DTU之间的性能。